Summary
여기서는 짧은 처리 시간, 낮은 비용 및 높은 처리량의 장점을 가진 이수성 (PGT-A)에 대한 착상 전 유전자 검사를위한 반도체 염기서열 분석 방법을 소개합니다.
Abstract
염색체 이수성, 배아 발달 체포, 이식 실패, 또는 임신 손실로 이끌어 내는 주요 원인의 한개는, 인간 적인 태아에서 잘 문서화되었습니다. 이수성 (PGT-A)에 대한 착상 전 유전자 검사는 배아의 염색체 이상을 검출하여 생식 결과를 크게 향상시키는 유전자 검사입니다. 차세대 염기서열 분석(NGS)은 유전자 분석을 위한 높은 처리량과 비용 효율적인 접근 방식을 제공하며 PGT-A에서 임상 적용가능성을 보여주었습니다. 여기서, 우리는 배아에서 이수성 의 스크리닝을 위한 신속하고 저비용 반도체 염기서열 NGS 방법을 제시한다. 워크플로우의 첫 번째 단계는 생검된 배아 시편의 전체 게놈 증폭(WGA)이며, 그 다음에는 시퀀싱 라이브러리의 시딩 및 반도체 시퀀싱 시스템의 후속 시퀀싱이 뒤따릅니다. 일반적으로 PGT-A 애플리케이션의 경우 각 칩에 24개의 샘플을 로드하고 시퀀싱하여 150개의 기본 쌍의 평균 판독 길이에서 60-8000만 개의 판독을 생성할 수 있습니다. 이 방법은 시퀀싱 라이브러리의 템플릿 증폭 및 보강을 수행하기 위한 정교한 프로토콜을 제공하여 PGT-A 감지를 재현 가능, 높은 처리량, 비용 효율적이고 시간 절약으로 만듭니다. 이 반도체 시퀀서의 실행 시간은 2-4 시간이며 샘플 수신에서 보고서 발행까지 소요 시간이 5 일로 단축됩니다. 이 모든 이점은 이 분석법을 배아에서 염색체 이수성을 검출하고, 따라서 PGT-A에 있는 그것의 넓은 응용을 촉진하는 이상적인 방법합니다.
Introduction
보조 생식에 있는 전송을 위한 일반적인 염색체 사본 수 (euploid)를 가진 좋은 질 실행 가능한 태아를 선택하는 것은 임신 결과를 향상하는 것을 돕습니다. 전통적으로, 잘 확립 된 형태 학적 등급 시스템은 쉽게 가용성과 비 침습적 특성으로 인해 배아 평가에 널리 사용됩니다. 그러나, 형태학적 평가는 배아 질1 및 이식 잠재력2에대한 제한된 정보만 제공할 수 있는 것으로 나타났다. 한 가지 근본적인 이유는 배아의 염색체 조성을 평가할 수 없기 때문입니다.
염색체 이수성 (염색체의 비정상적인 카피 수)은 배아 발달 체포, 이식 실패 또는 임신 손실로 이어지는 주요 원인 중 하나입니다. 이수성의 발생은 인간 배아에서 잘 문서화되어 있으며, 골반포 낭포제3,4 및 50 %-60 %에서 60 %를차지합니다5. 이는, 어느 정도, 체외 수정 (IVF) 치료의 임신 율을 개선에 병목 현상에 기여하고있다, 이는 약에서 유지하고있다35%-40% 6,7. 그러므로, 전송을 위한 euploid 태아를 선택하는 것은 임신 결과 향상을 위해 유익할 것으로 믿어집니다. 이를 위해, 이수성 (PGT-A)에 대한 착상 전 유전자 검사는 유전 적 접근을 사용하여 배아 생존가능성을 조사하기 위해 추가로 개발되었다. PGT-A의 중요한 역할을 지원하는 무작위 통제 실험 및 코호트 연구의 수가 증가하고 있습니다. PGT-A의 적용은 유산율을 감소시키고 임상 임신율과 이식율 8,진행 중인 임신율 및 출산율9를증가시키는 것으로 입증되었다.
역사적으로, PGT-A에서 다양한 방법이 적용되어 왔으며, 이러한 경우 형광은 체자형화(FISH), 비교 게놈 혼성화(CGH), 어레이-CGH, 및 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP)-마이크로어레이이다. 이전 연구는 물고기에 의한 분열 단계 배아에 대한 PGT-A가 59273array-CGH 또는 를 사용하여 해당 배반포의 포괄적 인 염색체 스크리닝 (CCS)에 의해 얻은 것과 제대로 일치하지 않는 결과를 산출한다는 것을 나타났습니다. SNP-마이크로어레이5927310. 이러한 불일치는 개발11동안 염색체 분리 오차의 염색체 모자이크, FISH 기술 적 유물 또는 배아 자기 교정에 기인할 수 있다. 어레이-CGH 또는 SNP-마이크로어레이와 같은 어레이 기반 PGT-A에 대한 배반포 트로프토더(TE) 생검을 사용하는 것이 배아10,12에서염색체 불균형을 식별하는 데 효과적이라는 것이 널리 인식되고 있다. 최근, 단세포 차세대 염기서열 분석(NGS)은 유전자 분석을 위한 높은 처리량과 비용 효율적인 접근법을 제공하며 PGT-A13,14,15에서임상 적 적용성을 보이고 있으며, 이는 현재 사용 가능한 방법에 대한 유망한 대안.
여기에서, 우리는 인간 배아에서 이수성의 검열을 위한 빠르고, 견고하고, 저가의 반도체 염기서열 NGS 방법을 제시합니다. 워크플로우의 첫 번째 단계는 생검된 배아 시편의 전체 게놈 증폭(WGA)이며, 단일 세포 WGA 키트를 사용한 다음 시퀀싱 라이브러리를 시빙하고 반도체 시퀀싱 시스템에서 후속 시퀀싱을 수행합니다.
DNA 가닥 합성 시 각 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트 혼입에서 방출되는 H+ 이온을 검출함으로써, 시스템은 반도체 소자로부터 포착된 화학적 신호(pH 변화)를 디지털 데이터를 직접 전달한다. , 이는 DNA 서열 정보로 더 해석된다. 고가의 광학 검출 및 복잡한 시퀀싱 반응에 대한 요구 사항을 제거한 이 간단한 시퀀싱 화학은 총 시약 비용을 줄이고 시퀀싱 실행 시간을 2-4시간16시간으로단축합니다. 더 중요한 것은 제조업체의 성능 사양에 따라 반도체 시퀀싱 플랫폼은 실행당 최대 15GB 의 시퀀싱 데이터(라이브러리 품질에 따라 다름)를 생성할 수 있으며, 이는 다른 시퀀서보다 훨씬 높다는 것입니다. 약 3-4GB 데이터(2 x 75bp 읽기 길이)만 생성합니다17. PGT-A의 임상 적용에서 이 플랫폼은 칩당 24개의 샘플을 생성하여 최대 8,000만 개의 읽기17개 및 각 샘플의 최소 100만 개의 고유 판독을 달성할 수 있습니다. 판독 깊이는 각 샘플이 적어도 0.05x 전체 게놈 커버리지를 가지고 있는지 확인할 수 있습니다. 이 플랫폼의 위의 장점은 이상적인 스크리닝 방법을 만들어 PGT-A18의광범위한 응용 프로그램을 용이하게합니다.
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Protocol
홍콩 공동 중국대학-신계 동쪽 클러스터 임상 연구 윤리위원회(참조 번호: 2010.432)에 의해 윤리적 승인이 부여되었습니다. 연구 라이센스는 홍콩의 인간 생식 기술위원회 (번호 R3004)에 의해 승인되었습니다.
1. 전체 게놈 증폭
- 시작하기 전에 자기 비드 (재료표)의 부피를 확인하여 각 샘플에 대해 135 μL (20 % 초과)이 없는지 확인하십시오. 자기 비드를 실온(RT)에서 30분 이상 유지하십시오. 각 샘플에 대해 70% 에탄올의 720 μL(20% 초과)을 준비합니다. 열 사이클러(재료표)를 105 °C에서 가열 된 뚜껑을 장비하십시오.
참고 : 새로 준비 된 70% 에탄올 (재료 표)은 3 일 이내에 사용해야합니다. - 샘플 준비
참고 : 일상적인 연습에서, 배반포의 5 ~ 10 trophectoderm 세포는 연습 지침19에따라 생검된다.- 단일 0.2 mL 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 튜브에서 1x 인산 완충 식염수 (PBS)의 2 μL에서 생검을 일시 중단하십시오.
- 작은 원심분리기에서 튜브를 3초 간 간단히 돌리면 물방울을 수집합니다.
- 세포 분석 및 추출
- 세포 추출 완충제(표 재료)와 추출 효소 희석 완충제(표의 재료표)를 얼음, 소용돌이에 해동하고 사용하기 전에 미니 원심분리기를 3초 간 간략하게 돌린다.
- 1.2.2단계에서 각 튜브에 3 μL의 세포 추출 버퍼를 추가합니다.
- 추출 효소 희석 완충액 4.8 μL 및 0.2 μL 세포 추출 효소(표 재료)를첨가하여 각 시료에 대해 5 μL 세포 용해 마스터 믹스를 준비한다. 1.3.2 단계에서 각 튜브에 잘 섞고 양치를 섞습니다. 튜브를 부드럽게 뒤집고 미니 원심 분리기를 3초 동안 간단히 돌봅입니다.
참고 : 팁마스터 믹스를 추가 할 때 세포 샘플을 포함하는 액체를 만지지 않아야합니다. - 가열 된 뚜껑으로 열 사이클러에서 1.3.3 단계에서 튜브를 배양합니다. 다음과 같은 설정으로 프로그램을 실행합니다: 75°C에서 10분, 95°C에서 4분, 4°C에서 유지합니다.
- 전암화
- 얼음, 소용돌이에 전암화 버퍼(재료의 표)를해동하고 사용하기 전에 3 s에 대한 미니 원심 분리기에 잠시 회전.
- 4.8 μL의 프리앰블화 완충액과 0.2 μL의 프리앰블화 효소(재료 표)를 첨가하여 각 시료에 대해 5 μL 프리앰블화 마스터믹스를준비한다. 1.3.4 단계에서 각 튜브에 잘 섞고 양치를 섞습니다. 튜브를 부드럽게 뒤집고 미니 원심 분리기를 3초 동안 간단히 돌봅입니다.
참고 : 팁마스터 믹스를 추가 할 때 DNA 샘플을 포함하는 액체를 만지지 않아야합니다. - 가열 된 뚜껑으로 열 사이클러에서 튜브를 배양하십시오. 흐르는 설정으로 프로그램을 실행 : 95 ° C에서 2 분; 95°C에서 15s, 15°C에서 50s, 25°C에서 40s, 35°C에서 30s, 65°C에서 40s, 75°C에서 40s; 4 °C에서 유지합니다.
- 증폭
- 얼음, 소용돌이에 증폭 버퍼(재료의 표)를해동하고 사용하기 전에 3 s에 대한 미니 원심 분리기에 잠시 회전.
- 증폭 버퍼 25 μL, 증폭 효소 0.8 μL(재료 표) 및 WGA용 뉴클레아제없는 물 34.2μL을 추가하여 각 샘플에 대해 60 μL 증폭 마스터 믹스를 준비합니다(재료 표). 1.4.3 단계에서 각 튜브에 잘 섞고 양치를 섞습니다. 튜브를 부드럽게 뒤집고 미니 원심 분리기를 3초 동안 간단히 돌봅입니다.
- 가열 된 뚜껑으로 열 사이클러에서 튜브를 배양하십시오. 다음과 같은 설정으로 프로그램을 실행 : 95 ° C에서 2 분; 95°C에서 15s에 대한 14 사이클, 65°C에서 1분, 75°C에서 1분; 4 °C에서 유지합니다.
- 의 정화 이 에 WGA 제품
- 각 WGA 제품을 1.5.3단계에서 새로운 1.5mL 튜브로 옮김. 각 튜브에 112.5 μL의 자기 구슬을 추가합니다. 소용돌이와 5 분 동안 RT에서 배양.
참고: 사용하기 전에 마그네틱 비드를 완전히 섞으세요. - 튜브를 마그네틱 스탠드(재료표)에 3분 간 놓고 상급제가 분명해질 때까지 놓습니다. 구슬을 방해하지 않고 모든 상급을 버리십시오.
- 각 튜브에 70% 에탄올300 μL을 추가합니다. 각 튜브를 180° 회전하여 구슬이 에탄올을 통과하고 원래 위치로 다시 회전하도록 합니다. 구슬을 방해하지 않고 정착 한 후 모든 상급을 폐기하십시오. 이 단계를 한 번 반복합니다.
참고: 튜브를 수평으로 회전하는 동안 마그네틱 스탠드에 튜브를 고정합니다. - 3s. 튜브를 자기 스탠드에 놓고 잔류 상한자가 명확해질 때까지 각 튜브를 미니 원심 분리기에서 간단히 돌봅입니다. 구슬을 방해하지 않고 모든 잔류 상수체를 버린다. RT에서 구슬을 약 3분 동안 건조시면 됩니다.
- 마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거하고 35 μL의 낮은 Tris-EDTA (TE) 버퍼(재료표)를 추가하여 말린 구슬을 다시 일시 중단하십시오. RT에서 5분 동안 배양합니다.
- 상급체가 명확해질 때까지 튜브를 자기 스탠드에 3분 동안 놓습니다. 용출된 DNA를 함유한 모든 상급물질을 구슬을 방해하지 않고 새로운 1.5 mL 튜브로 옮김.
- 각 WGA 제품을 1.5.3단계에서 새로운 1.5mL 튜브로 옮김. 각 튜브에 112.5 μL의 자기 구슬을 추가합니다. 소용돌이와 5 분 동안 RT에서 배양.
2. WGA 제품의 품질 관리
- 제조자의 설명서에 따라 1.6.6 단계부터 WGA 제품의 1μL을 원료로 사용하여 제조자의 설명서에 따라 각 정제 된 WGA 제품을 정량화합니다.
참고: WGA 제품의 허용 농도는 ≥ 10 ng/μL입니다. 이 임계값 미만의 제품은 다음 단계로 진행하지 않는 것이 좋습니다.
3. WGA 제품의 조각화
- 시작하기 전에 드라이 블록 히터를 37 °C로 예열합니다. 각 샘플에 대해 0.5 M EDTA의 6 μL(20% 초과)을 준비합니다. 농도에 기초하여, 각 정제된 WGA 제품으로부터 의 DNA 300 ng을 새로운 0.2 mL PCR 튜브로 1.6.6 단계로 하고 각 튜브에 뉴클레아제 없는 물로 16 μL로 부피를 가져온다.
-
조각화
- dsDNA 단편화 반응 완충액 2 μL(재료 표)과 dsDNA 단편화 효소 2μL(재료표)을 첨가하여 각 시료에대해 4 μL 이중 연선 DNA(dsDNA) 단편화 반응 혼합물을 준비한다. 3.1 단계에서 각 튜브에 잘 섞고 양칭을 섞습니다. 소용돌이및 3s. 가열된 뚜껑이 있는 열 사이클러에서 37°C에서 25분 동안 튜브를 인큐베이션하는 미니 원심분리기에서 잠시 회전시다.
- 각 튜브에 즉시 0.5 M EDTA의 5 μL을 추가합니다. 소용돌이에 의해 잘 혼합하고 3 s에 대한 미니 원심 분리기에 잠시 회전.
-
정화 및 재서스펜션
- 각 제품을 3.2.2단계에서 새로운 1.5mL 튜브로 옮김. 각 튜브에 37.5 μL의 자기 구슬을 추가합니다. 정점으로 섞고 RT에서 5분 동안 배양합니다.
- 1.6.2 단계부터 1.6.4 단계까지 설명된 대로 제품을 정제한다.
- 1.6.5 단계 및 1.6.6 단계에 기재된 바와 같이 각 정제된 생성물을 32 μL의 저TE 버퍼를 첨가하여 용출한다.
4. 도서관 건설
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무딘- 전자 (것)이 nd r 이도, 크기 선택 및 정제
- 각 샘플에 대해 9.5 μL의 뉴클레아제 없는 물, 10 μL의 5x 말단 수리 버퍼를 추가하여 각 샘플에 대해 20 μL 무딘 말단 수리 믹스를 준비합니다(3.3.3단계의재료튜브 표. 소용돌이와 3 s에 대 한 미니 원심 분리기에 간단히 회전.
- 4.1.1단계에서 각 튜브에 50 μL의 자기 구슬을 추가합니다. 소용돌이와 5 분 동안 RT에서 배양.
참고: 사용하기 전에 마그네틱 비드를 완전히 섞으세요. - 각 튜브를 자기 스탠드에 3분 동안 놓고 상급제가 분명해질 때까지 놓습니다. 모든 상급을 각각 25 μL 자기 구슬이 추가되는 새로운 1.5 mL 튜브로 옮김. 이송된 상상과 튜브를 소용돌이시키고 RT에서 5분 동안 배양한다.
- 1.6.2단계부터 1.6.4단계까지 설명된 바와 같이 배양된 튜브에서 제품을 정제한다.
- 1.6.5 단계 및 1.6.6 단계에 기재된 바와 같이 각 정제된 생성물을 32 μL의 저TE 버퍼를 첨가하여 용출한다.
참고: 이것은 안전한 중지 지점입니다. 이 단계에서 정제된 DNA는 24시간 이하의 4°C에서 안정하다.
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어댑터 l igation 및 p 유화
- 각 샘플에 17 μL 어댑터 결찰 혼합물을 준비하여 10 μL의 무염수, 5 μL의 10x 리가제 완충제(재료표),P1 어댑터 1 μL(재료표),DNA 리가제 1 μL(재료 표)을 첨가합니다. 5s에 대한 소용돌이에 의해 잘 혼합하고 15 s에 대한 미니 원심 분리기에 회전, 단계 4.1.5에서 각 튜브에 aliquot.
- 샘플 시트에 따라 4.2.1 단계에서 각 튜브에 어댑터 1 μL (재료 표)을 추가하십시오 (보충파일: 어댑터 결찰용 샘플시트). 소용돌이및 3 s. 20 분 동안 RT (20−25 °C)에서 튜브를 인큐베이션하는 미니 원심 분리기에 잠시 회전합니다.
- 4.2.2단계에서 각 튜브에 75 μL의 자기 구슬을 추가합니다. 정점으로 섞고 RT에서 5분 동안 배양합니다. 이어서, 1.6.2단계부터 1.6.4단계까지 기재된 바와 같이 제품을 정제한다.
- 1.6.5 단계 및 1.6.6 단계에 기재된 바와 같이 각 정제된 생성물을 15 μL의 저TE 버퍼를 첨가하여 용출한다. 용출된 DNA를 함유한 모든 상상물질을 새로운 0.2 mL 8-튜브 스트립으로 옮김.
참고: 이것은 안전한 중지 지점입니다. 이 단계에서 정제된 DNA는 24시간 이하의 4°C에서 안정하다.
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증폭 및 정제
- 슈퍼 믹스 (재료 표)와 프라이머 믹스 2.5 μL (재료표)를 추가하여 각 샘플에 대해 50 μL 증폭 마스터 믹스를 준비합니다. 소용돌이에 의해 잘 혼합하고 미니 원심 분리기에 잠시 회전하고 단계 4.2.4에서 0.2 mL 8 튜브 스트립으로 aliquot.
- 30 s에 대 한 스트립 소용돌이 하 고 3 s에 대 한 미니 원심 분리기에 잠시 회전. 가열 된 뚜껑으로 열 사이클러에 스트립을 인큐베이션. 다음과 같은 설정으로 프로그램을 실행 : 72 °C에서 20 분; 95°C에서 5분; 95°C에서 15s, 62°C에서 15s, 70°C에서 1분 동안 10사이클; 70°C에서 5분; 4 °C에서 유지합니다.
- 각 제품을 4.3.2단계에서 새로운 1.5mL 튜브로 옮김. 각 튜브에 97.5 μL의 자기 구슬을 추가합니다. 소용돌이로 섞어서 RT에서 5분 동안 배양합니다.
- 1.6.2 단계부터 1.6.4 단계까지 설명된 대로 제품을 정제한다.
- 1.6.5 단계 및 1.6.6 단계에 기재된 바와 같이 각 정제된 생성물을 25 μL의 저TE 버퍼를 첨가하여 용출한다.
5. DNA 라이브러리의 품질 관리 및 희석
- 제조자의 매뉴얼에 따라 형광계 분석에 의해 단계 4.3.5로부터 제조된 각 DNA 라이브러리를 2 μL을 원료로 사용하여 정량화하였다.
- DNA 라이브러리의 허용된 농도는 ≥ 0.5 ng/μL이고 양성 대조군(물자표)의농도는 ≤ 15 ng/μL이다. 양성 대조군 농도가 15 ng/μL에서 너무 많이 변하는 경우, 농도가 15 ng/μL에 가까워질 때까지 양성 대조군을 정량화한 것을 반복한다. 라이브러리의 농도가 0.5 ng/μL 미만이면 조각화(섹션 3)에서 다시 시작합니다.
참고: DNA 라이브러리를 정량화하기 전에 양성 대조군 농도가 허용된 값에 도달하도록 합니다. - 뉴클레아제없는 물을 추가하여 각 라이브러리를 100 pmol로 희석시다. 뉴클레아제 없는 물 n μL에 라이브러리 1 μL을 추가; 아래 방정식을 사용하여 n을 계산하십시오.
여기서 Q는 형광계 분석및 C에 의해 측정된 각 라이브러리의 농도는 형광계 분석에 의해 측정된 양성 대조군농도이다.
6. 시퀀싱
- 시작하기 전에 각 샘플에 대해 1 M NaOH의 48 μL (20 % 초과)과 1 개의 뉴클레아제 프리 1.5 mL 튜브를 준비하십시오. RT에서 마스터 믹스 PCR 버퍼 (재료표)(2000 μL 부피)를해동하십시오.
- 라이브러리 풀링
- 소용돌이 는 단계 5.3에서 각 희석 라이브러리와 짧은 3 s에 대한 미니 원심 분리기에 4x 회전 매번. 각 라이브러리의 5 μL을 가지고 뉴클레아제 없는 1.5 mL 튜브로 풀을 합니다. 혼합 라이브러리를 소용돌이시키고 3 초 동안 미니 원심 분리기를 잠시 돌입니다.
- 에멀젼 시스템을 이용한 에멀젼 PCR
- 2개의 새로운 회수 튜브(재료 표)에 150 μL의 브레이킹 용액을 추가합니다. 새로운 복구 튜브, 복구 라우터 및 증폭 플레이트를 설치합니다.
- 오일 병 (재료표)를3 번 뒤집어 섞는다. 오일 및 회수 용액(재료 표)이 적어도 2/3 이상이면 됩니다.
- 30s에 대한 마스터 믹스 PCR 버퍼를 소용돌이하고 3 s. 소용돌이 구 입자및 혼합 라이브러리를 1 분 동안 6.2.1 단계에서 미니 원심 분리기에서 잠시 회전하고 3 s에 대한 미니 원심 분리기에서 잠시 회전합니다.
- 2400 μL 결찰 혼합물을 172 μL의 뉴클레아제 없는 물, 단계 6.3.3, 120 μL의효소 혼합(재료 표)에서 혼합 라이브러리의 8 μL을 첨가하고, 2000 μL 마스터 믹스 PCR 버퍼를 함유하는 튜브에 구체 입자 100 μL을 첨가한다.
- 파이펫을 800 μL로 설정합니다. 1000P 파이펫을 사용하여 반응 필터에 200 μL의 반응 오일을 추가합니다.
- 프로그램 양성자: 이온 PI Hi-Q OT2 200키트를 선택한 다음 보조 버튼을 선택하여 모니터의 지침에 따라 장치가 올바르게 설정되었는지 확인합니다. 그런 다음 다음을 클릭하여 프로그램을 시작합니다.
- 자동 농축 시스템에 의한 농축
- 에멀젼 PCR 프로그램이 완료되면 다음을 클릭한 다음 최종 회전을 클릭하여 10분 동안 회전합니다. 뚜껑열기를 클릭한 후 2개의 복구 튜브를 꺼냅니다.
- 각 튜브에 100 μL이 남아있을 때까지 2 개의 회수 튜브에서 상판을 버리고 그에 따라 라벨을 붙입니다. 용액을 잘 혼합하고 새로운 1.5 mL 튜브로 옮김.
- 각 회수 튜브에 200 μL의 뉴클레아제를 추가하고, 여러 번 파이펫팅하여 세척하고, 6.4.2 단계에서 모든 용액을 1.5 mL 튜브로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 넣습니다. 세척 단계를 한 번 반복합니다.
- 200 μL의 뉴클레아제 없는 물을 회수 튜브 중 하나에 추가하고 여러 번 파이펫팅하여 세척합니다. 모든 용액을 다른 회수 튜브로 옮기고 여러 번 위아래로 파이펫팅하여 세척하십시오. 이어서, 모든 용액을 6.4.3단계에서 동일한 1.5 mL 튜브로 전송한다. 소용돌이 1.5 mL 튜브 30 s와 원심 분리기 8 분 에 대 한 15,500 x g.
참고: 이 단계에서 에멀젼 PCR 제품의 최종 총 부피는 약 1200 μL이어야 합니다. - 튜브에 상류를 버리고 에멀젼 PCR 제품의 20 μL을 유지합니다. 튜브에 재서스펜션 용액 80 μL(재료 표)을 추가합니다. 위아래로 파이펫팅하여 섞으세요.
- 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트 용액(재료 표)과 1 M NaOH의 40μL을 추가하여 각 칩에 320 μL 용융 용액을 준비합니다.
참고: 1 M NaOH는 4°C에서 보관하거나 신선하게 제조해야 합니다. 사용 전에 소용돌이. - 30초 동안 C1 비드(재료 표)를 함유한 튜브를 소용돌이. 새로운 1.5 mL 튜브에 C1 구슬 100 μL을 가져 가라. 1.5 mL 튜브를 RT에서 2 분 동안 자기 스탠드에 놓습니다. 구슬이 구슬을 방해하지 않고 정착 한 후 모든 상급을 폐기하십시오.
- 6.4.7 단계에서 튜브에세척 용액 C1 (재료 표)의 1 mL을 추가합니다. 30 s. RT에서 자기 스탠드에 튜브를 놓습니다. 구슬이 구슬을 방해하지 않고 정착 한 후 모든 상급을 폐기하십시오. 비드 포획 용액 130 μL을 추가하여비드를 다시 일시 중단합니다(재료 표).
-
농축 시스템 (ES) 설정
- 샘플(100 μL 에멀젼 PCR 생성물)을 단계 6.4.5로부터, 세척된 비드(130 μL)를 단계 6.4.8로부터,ES 세척 용액(300 μL)(재료표)에서 8-튜브 스트립으로 6.4.6단계로 적재한다. 레이아웃 순서는 : 샘플 (튜브 1), 세척 비드 (튜브 2), ES 세척 용액 (튜브 3, 4, 5), 및 용융 액 (튜브 7). 튜브 6과 8을 비워 두십시오.
- 단계 6.4.9.1에서 8튜브 스트립을 ES에 놓습니다. 파이펫 팁과 새로운 0.2 mL 튜브를 설치하고 프로그램을 시작합니다.
참고: 파이펫팅이 정상적으로 작동하는지 확인합니다.
- 농축이 완료된 후 구 입자를 세척합니다.
- 15,500 x g에서5 분 동안 단계 6.4.9.2에서 0.2 mL 튜브를 원심 분리기. 상급물을 버리고 농축 제품의 10 μL을 유지하십시오. 튜브에 200 μL의 뉴클레아제 없는 물을 추가합니다. 소용돌이로 섞으세요.
- 원심 분리기 0.2 mL 튜브에서 5 분 에서 15,500 x g. 상급물을 버리고 농축 제품의 10 μL을 유지하십시오. 튜브에 90 μL의 뉴클레아제 없는 물을 추가합니다. 소용돌이로 섞으세요.
- 템플릿 준비
- 소용돌이 긍정적 인 제어 및 짧은 회전. 100 μL 템플릿(6.4.10.2단계의 농축 생성물)에 5 μL의 포지티브 컨트롤을 추가합니다. 소용돌이 및 원심분리기 15,500 x g에서5 분. 상급을 버리고 템플릿의 10 μL을 유지하십시오.
- 6.5.1단계에서 템플릿 튜브에 시퀀싱 프라이머 20 μL(재료 표)과 어닐링 버퍼 15 μL(재료표)을추가합니다. 튜브를 소용돌이시키고 3 초 동안 미니 원심 분리기를 잠시 돌입니다.
- 가열 된 뚜껑으로 열 사이클러에서 단계 6.5.2에서 튜브를 배양합니다. 다음 설정으로 프로그램을 실행: 95 °C에서 2 분, 37 °C에서 2 분, 4 °C에서 유지.
- 6.5.3 단계에서 튜브에 10 μL의 로딩 버퍼(재료표)를 추가합니다. 위아래로 파이펫팅하여 섞으세요.
- 시퀀서 초기화
- 질소 가스의 탱크 압력을 확인 (총 압력 ≥ 500 psi, 출력 압력 ≥ 10 psi, 최적의 20-30 psi). C1 및 C2 튜브(재료표)에 100 mL 탈이온수 (18.2 MΩ)를 상향식 및 시퀀서에 해당 C1 및 C2 위치에 설치합니다.
- W1(32 μL 의 1 M NaOH) 및 W3(W3 버퍼의40-50 mL [재료 표]) 솔루션을 준비합니다. 1920 mL의 탈이온수(18.2MΩ), 전체 W2 버퍼(재료 표)및 1M NaOH의 8-12 μL을 추가하고 4-8회 혼합하여 W2 용액을 준비합니다.
참고: 수질은 지질학적으로 다르므로 필요에 따라 1M NaOH의 부피를 조정합니다. W2의 시작 pH는 5.9-6.1이며 조정 후 최적의 범위는 7.4-7.6입니다. 새로운 시약 튜브를 교체하고 설치하고 최근에 사용한 칩을 세척에 사용하십시오. - 시퀀싱 보충 키트 (재료 표)에서 4개의 새로운 빈 튜브를 준비하십시오. 4개의 튜브를 dGTP, dCTP, dATP 및 dTTP로 라벨을 부착하고, dGTP, dCTP, dATP또는 dTTP(재료 표)의 70 μL을 해당 튜브(즉, 70 μL dGTP)를 dGTP로 표시된 튜브에 추가합니다. 사용하기 전에 튜브를 소용돌이. 시퀀서 (재료 표)에 지정된 해당위치에 튜브를 설치합니다.
- 칩 워시
- 칩(재료표)을칩의 로딩 웰에 100 μL의 이소프로판올을 주입하여 한 번 세척한다. 반대쪽 에서 배출 된 액체를 제거하십시오.
- 칩의 로딩 웰에 100 μL의 뉴클레아제 없는 물을 주입하여 칩을 두 번 세척합니다. 반대쪽 에서 배출 된 액체를 제거하십시오.
- 칩의 로딩 웰에 0.1 M NaOH의 100 μL을 주입하여 칩을 한 번 세척합니다. 반대쪽 에서 배출 된 액체를 제거하십시오. RT에서 1분 동안 배양합니다.
- 칩의 로딩 웰에 100 μL의 뉴클레아제 없는 물을 주입하여 칩을 한 번 세척합니다. 반대쪽 에서 배출 된 액체를 제거하십시오.
- 칩의 로딩 웰에 이소프로판올 100 μL을 주입하여 칩을 두 번 세척합니다. 반대쪽 에서 배출 된 액체를 제거하십시오. 질소를 칩에 불어 건조시. 빛으로부터 멀리하십시오.
- 시료 로딩 및 시퀀싱
- 6.5.4 단계에서 55 μL 샘플을 위아래로 파이펫팅하여 혼합하고 샘플을 칩의 로딩 웰에 로드합니다.
참고: 이 단계에서 사용되는 파이펫 팁과 0.2mL PCR 튜브를 보관하십시오. - 칩을 칩 미니 원심분리기(재료표)에 놓습니다.
- 어닐링 버퍼 및 플러싱 용액을 위해 두 개의 새로운 1.5 mL 튜브를 준비합니다. 500 μL의 어닐링 버퍼와 500 μL의 뉴클레아제 없는 물을 추가하여 50% 어닐링 버퍼를 준비합니다. 어닐링 버퍼 500 μL과 100 % 2 프로판올 500 μL을 추가하여 플러싱 용액을 준비합니다.
- 2개의 새로운 1.5 mL 튜브를 준비하고 두 튜브에 49 μL의 50% 어닐링 버퍼 및1 μL의 발포 용액(재료 표)을 혼합하여 발포 혼합물을 준비한다.
- 파이펫을 100 μL로 설정합니다. 6.8.4 단계에서 두 튜브 중 하나에서 발포 혼합물로 공기를 피펫팅하여 기포를 만듭니다. > 120 μL의 거품을 만들고 눈에 띄는 기포가 보이지 않을 때까지 파이펫팅을 유지하십시오. 120 μL의 기포를 적재에 잘 로드합니다.
참고: 눈에 띄는 거품이 없는지 확인합니다. 그렇지 않으면 다시 시작합니다. - 6.8.5단계에서 배수구에서 파이펫팅을 통해 적재물까지 과도하게 배출된 액체를 이송한다. 파이펫 버블을 하지 마십시오. 칩 미니 원심 분리기에 30s용 칩을 원심 분리합니다.
- 6.8.4단계에서 발포 혼합물을 함유하는 제2 튜브를 이용하여 6.8.5단계를 반복한다.
- 50% 어닐링 버퍼의 55 μL을 6.8.1단계에서 보관된 0.2 mL 튜브에 추가합니다. 6.8.1단계에서 보관된 파이펫 팁을 사용하여 파이펫을 위아래로 유지합니다. 모든 55 μL 어닐링 버퍼를 로딩웰에 로드합니다. 지정된 칩 미니 원심 분리기에 30s용 칩을 원심 분리합니다.
- 100 μL의 플러싱 용액을 칩 로딩에 잘 로드하고 배출된 액체를 잘 배출합니다. 이 로딩 단계를 한 번 반복합니다.
참고 : 칩에 거품이있는 경우, 큰 거품에 의해 작은 거품을 추방하고 용액을 플러싱하여 플러시. 이는 플러싱 용액 100 μL을 파이펫팅하고 플러싱 솔루션 아래에 5 μL의 공기를 남기면 달성할 수 있습니다. 따라서, 105 μL을 칩에 파이펫팅할 때, 공기는 작은 기포를 배출할 수 있는 큰 거품을 형성할 것이고, 그 후, 큰 기포는 다음의 플러싱 용액에 의해 추방될 수 있다. - 50% 어닐링 버퍼의 100 μL을 칩 로딩웰에 로드합니다. 이 로딩 단계를 총 3회 반복합니다.
- 시퀀싱 효소 6 μL을 50% 어닐링 버퍼의 60 μL에 새로운 1.5 mL 튜브에 넣습니다. 위아래로 파이펫팅하여 섞으세요. 이 혼합 용액의 65 μL을 칩 로딩에 잘 로드합니다. 거품을 피하기 위해 천천히 파이펫.
- 칩을 빛으로부터 멀리 하고 RT에서 5분 동안 배양합니다.
- 인큐베이션 후 즉시 칩을 시퀀서에 로드하고 화면에서 시퀀싱 시작을 클릭하여 시퀀싱을 시작합니다.
참고: 시퀀싱 원시 데이터 및 품질 관리 파일은 데이터 분석을 위해 회사에 자동으로 업로드됩니다.
- 6.5.4 단계에서 55 μL 샘플을 위아래로 파이펫팅하여 혼합하고 샘플을 칩의 로딩 웰에 로드합니다.
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Representative Results
이 수정된 프로토콜에 기초하여, 반도체 염기서열 분석 플랫폼은 처음으로 PGT-A에 적용되었다. 우리는 분열 단계 배반및 배반포 단계 태아 둘 다에서 생검에 시험했습니다. 생검 된 세포는 DNA의 저하를 방지하기 위해 가능한 한 빨리 WGA를 겪는 것이 좋습니다. 이전 연구는 상이한 WGA 방법의 성능을 비교하고 우리가 여기서 설명한 방법은 100 KB20의빈 크기에서 최고의 균일성을 가졌다는 것을 나타냈다. 균일성과 중앙값 절대 쌍차이(MAPD)21의성능을 고려하여, 이 WGA 방법은 반도체 시퀀서를 사용하여 PGT-A에 대해 선택되었다. 186개의 분열 단계 및 1135개의 배반포 단계 배아에 대한 회고적 통계 분석을 통해, 우리는 WGA 성공률이 블라스토미어 샘플에서 95.4%,배반포시스트 샘플에서 96.9%였다는 것을 관찰하였다(그림 1). 크기 선택 절차로서 라이브러리 시공 전의 정화 단계는 큰 DNA 단편을 포착하여 염기서열 분석 품질에 매우 중요했습니다. 또한, 라이브러리 시공을 위한 300 ng의 입력량을 용이하게 했다. 효소 조각화 방법을 통해 WGA 제품을 약 160bp로 효율적으로 전단할 수 있었습니다.
데이터 분석은 유클리드 거리 및 원형 이진 세분화(EDCBS) 분석 시스템을 사용하여 수행되었다. 이 생물 정보학 알고리즘의 견고성을 평가하기 위해 사내 검증이 수행되었습니다. 우리는 100 KB의 빈 크기를 분석하여 알려진 karyotype와 66 세포주에서 379 WGA 제품을 시퀀싱을 통해 PGT-A 전용 참조 데이터베이스를 설립했다. 이 데이터베이스에서 참조 범위는 CNV(복사 번호 변형) 호출에 대한 임계값으로 설명되었고 10MB는 검출 수준에 대한 컷오프로 설정되었습니다. 감도 및 특이성 모두 이 임계값에서99% 이상에 도달했습니다(표 1). 배아 생검에 대한 PGT-A 적용에서, 윈도우 크기는 충분히 읽기에 도달하기 위해 슬라이딩 윈도우 접근법을 사용하여 400 KB로 설정되었다. 각 샘플의 품질 관리(QC)는 고유 판독, MAPD 및 카피 번호 변형(CNV∙SD)의 표준 편차에 의해 결정되었다. 3개의 인덱스 중 하나를 초과하는 샘플은QC 실패로 정의되었다(도 2C). 염색체 산란도의 해석(그림 2A,B, D)는 DECIPHER, DGV, 또는 ClinGen 데이터베이스에 확인된 CNV를 비교하여 워크플로우를 따르는 자격을 갖춘 유전학자에 의해 수행되었습니다. 개별 불일치는 전문가 큐레이션 절차에 의해 통제되었습니다. 염색체 이상은 배반포 샘플에서 이수성 및 모자이크으로 그룹화되었다. 30%-70%의 범위 내에서 카피 수 이득 또는 손실은 모자이크 염색체 조성물을 운반하는 것으로 분류되었다; 그렇지 않으면, 결과는 유우미 또는 이원으로 해석 될 것이다. 본 연구에서, 유플로이드 비율은 블래스토미어에서 45.2%, 배반포에서 52.3%였으며, 이는 출판된 데이터22,23에메아리쳤다.
그림 1: 이 방법에 의해 시험된 1321개의 태아 생검의 인구 통계. (A) 186 개의 분열 단계 배아의 데이터. (B) 1135 배반기 배아의 데이터. WGA 성공률은 두 가지 유형의 표본 모두에서 95% 이상입니다. 시퀀싱 품질 관리 실패율은 분열 단계 그룹에서 3.4% 및 배반포 단계 그룹에서 1.9%에 불과합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 23쌍의 염색체에 대한 PGT-A 임상 적용의 대표적인 결과. 대표적인 결과(A) 유우피디; (B) 이수성 (seq[GRCh37] (2)x3, (21)x3); (C) CNV∙SD로 인한 시퀀싱 QC 실패 샘플 0.6571(수용 ≤ 0.4); (D) [55%) ] 4p16.3p15.1 (29.50 MB). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| CNV 임계값 | ||||||
| (-0.23, 0.20) | (-0.32, 0.26) | (-0.41, 0.32) | (-0.51, 0.37) | (-0.62, 0.43) | (-0.73, 0.48) | |
| 감도 | 100.00% | 100.00% | 100.00% | 100.00% | 98.30% | 96.02% |
| 특이성 | 72.41% | 81.03% | 91.38% | 99.10% | 99.54% | 100.00% |
표 1: 반도체 시퀀서에 의한 상이한 로그 R 비율 간의 민감도 및 특이성. 알려진 euploid karyotype 결과를 가진 240의 견본의 총은 이 방법에 의해 시험되고 다른 Log R 비율에서 불렸습니다.
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Discussion
다른 시퀀싱 화학과는 달리, 여기에 설명된 시퀀서는 뉴클레오티드 검출을 위해 반도체를 사용합니다. 칩 자체는 양성자 프로그램의 2−4 시간 시퀀싱 시간을 가능하게 하는 폴리머라제 구동 염기 통합17에의해 수소 이온을 검출하는 전자 장치입니다. 게다가, 칩은 다른 시퀀서 공급자에 의한 유동 세포 시퀀싱 화학과 다른 하나의 표적 분자의 국소화를 허용하는 마이크로웰 칩이다. 이 프로토콜은 PGT-A의 적용에 최적화된 수정된 프로토콜입니다. 최적화는 오염의 기회를 줄이기 위해 초음파 대신 효소 방법에 의해 증폭 된 DNA의 단편화뿐만 아니라 크기 선택및 저렴한 비용으로 더 나은 성능을 위한 PCR 시스템을 포함한다. 또한 임상 환경에서는 변이체 호출을 위해 검증된 사내 파이프라인을 사용했습니다.
연습 중에 주의해야 할 중요한 단계가 있습니다. 정제를 위한 에탄올은 실험 전에 신선하게 준비되어야 하며, 에탄올의 고농도는 오염된 DNA의 세척을 불충분하게 유발하는 반면, 낮은 농도는 표적 DNA의 손실을 야기할 것이다. 형광계는 정확도를 보장하기 위해 알려진 농도로 포지티브 컨트롤에 의해 보정되어야 합니다. 게다가 템플릿의 적절한 로딩은 시퀀싱에 매우 중요합니다. 올바른 크기의 거품은 템플릿 구를 마이크로웰에 밀어 넣는 데 도움이 되지만 거품이 너무 크면 부적절한 로드가 발생할 수 있습니다. 사용자는 각 실행에 대해 시퀀스로 정렬할 샘플 수(반드시 24개는 아님)를 수정할 수 있습니다. 이 칩을 위해 설계된 96 개의 인덱스가 있습니다. 그러나 칩당 샘플이 증가함에 따라 시퀀싱 판독 깊이가 감소합니다. 가장 일반적인 문제 중 하나는 낮은 라이브러리 농도, 잔류 에탄올 또는 자기 비드로 인해 정제에서 낮은 또는 가난한 품질의 DNA 출력에 기인 할 수있다, 또는 앞서 언급 한 바와 같이 구슬의 균열. 최적이 아닌 DNA 출력은 또한 정확한 샘플 입력 및 열 사이클러의 온도 검사와 마스터 믹스의 신중한 준비에 의해 수정될 수 있는 PCR의 낮은 효율에서 유래할 수 있습니다. CNV∙SD 값이 높은 샘플(그림 2C)과 같이 QC 실패시료의 경우 크기 분포 분석을 위해 바이오 분석기에서 샘플을 실행하는 것이 좋습니다.
이 방법의 한계 중 하나는 다른 플랫폼에 비해 더 높은 거짓 단일 뉴클레오티드 호출 속도입니다. 오차율은 1%로 다른 시퀀서(17)에 의한 0.1%에 불과한 거짓 긍정률에 비하여 1%이다. 그러나 이것은 CNV 호출 또는 PGT-A 분석을 위한 결정 요인이 아닙니다. 다른 플랫폼에 비해 에멀젼 시스템의 적용은 작동 불일치 및 파이펫팅 오류를 최소화하여 라이브러리 품질을 높입니다. 이는 dsDNA 농도가 매우 낮고 다음 라이브러리 풀링에 대한 정확한 정량화가 필요하기 때문에 다른 플랫폼에 비해 당사의 방법의 상당한 이점입니다. 당사의 방법은 검출 오류를 제어하기 위해 표준 포지티브 컨트롤을 사용하여 형광계 정량화의 교정을 도입했습니다.
처리 시간이 짧은 높은 처리량 플랫폼으로서, 반도체 시퀀서는 PGT-A에 이상적이며,24세의고급 모계 연령과 같은 PGT-A 임상 적응증을 가진 IVF 환자에게 널리 적용될 수 있다. Deleye 외. 다른 시퀀서(25)와반도체 시퀀서의 성능을 비교하기 위해 인간 배반 포세포의 병렬 시퀀싱을 실시했다. 또한, 이 PGT-A 키트는 중국 식품의약국(FDA)으로부터 "혁신적인 의료 기기에 대한 특별 승인 절차"를 획득했으며 수천 개의 배아에 임상적으로 사용되고 있습니다. 비용 면에서 이 플랫폼의 가격은 PGT-A 시장에서 일반적으로 사용되는 다른 플랫폼에 비해 기가 베이스당 가격의 절반입니다. 영양세포는 배아(26)의 유전적 체질을 안정적으로나타낼 수 있다. 이 방법은 트레프 외가27을입증한 바와 같이 단일제닉/단일 유전자 질환(PGT-M)에 대한 PGT를 위해 잠재적으로 개발될 수 있다. 그들의 모형에서, 그(것)들은 16의 태아 생검의 PGT-M에 300 MB에서 1 GB 처리량을 촉진하고 2개의 전통적인 PGT-M 방법에 결과를 비교했습니다. 16개의 샘플을 캡처하고 로딩함으로써, 그들의 방법은 대상 영역의 최소 100배 판독 깊이에 도달하여 100% 신뢰성 과 재현성27을초래하였다. 우리의 프로토콜에 의해 반도체 시퀀서의 처리량은 15 GB에 도달 할 수 있으며 설계 96 바코드가있다; 따라서 표적 PGT-M에 적용하는 경우, 상당수의 배아 생검을 높은 판독 깊이에서 하나의 칩에 의해 시퀀스화할 수 있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 연구는 홍콩의 일반 연구 기금 (참조 번호 14162417) 중국 국립 자연 과학 재단 (참조 번호 81860272), 광시 지방 과학 기술 재단의 주요 연구 계획에 의해 지원되었다 (참조 번호) AB16380219), 그리고 중국에서 중국 박사 후 과학 재단 보조금 (참조 번호 2018M630993).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR tubes, 0.2 mL | Axygen | PCR-02D-C | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575020 | |
| PBS, pH 7.4, Ca2+ and Mg2+ free | ThermoFisher | 10010023 | |
| 1.0 M NaOH (1.0N) solution | SIGMA-ALDRICH | S2567 | For Melt-off solution. Molecular grade |
| Eppendorf LoBind Tubes, 1.5 mL | Fisher Scientific | 13-698-791 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| ELGA PURELAB Flex 3 Water Purification System or Equivalent 18 MΩ water system |
ThermoFisher | 4474524 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| PicoPLEX WGA Amplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| PicoPLEX WGA Amplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion OneTouch Amplification Plate | In kit: Ion OneTouch 2 Supplies (Part No. A26367). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Ion PI Annealing Buffer | |||
| MyOne Beads Capture Solution | |||
| Agilent 2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939AA | |
| Ion OneTouch Breaking Solution (black cap) | In kit: Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFisher | 65001 | |
| PicoPLEX WGA Cell extraction buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-00. |
| PicoPLEX WGA Cell extraction enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion PI Chip Kit v3 | ThermoFisher | A26771 | |
| Ion Chip Minifuge, 230 V | ThermoFisher | 4479673 | |
| Ion PI dATP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI dCTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI dGTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| ThermoQ–Temperature Dry Bath | TAMAR | HB-T2-A | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
| NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348L | |
| Ion PI dTTP | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion OneTouch 2 Instrument | ThermoFisher | INS1005527 | ThermoFisher Catalog number: 4474778. |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Ion One Touch ES | ThermoFisher | 8441-22 | ThermoFisher Catalog number: 4469495. Extended kit component in Sheet 5 |
| Ethanol | SIGMA-ALDRICH | 51976 | This can be replaced by any brand's molecular grade absolute ethanol. |
| PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-01. |
| PicoPLEX WGA Extraction enzyme dilution buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-02. |
| Qubit 3.0 Fluorometer | ThermoFisher | Q33216 | This model has been replaced by Qubit 4 Fluorometer, Catalog number: Q33226. |
| Qubit ds DNA HS Assay kit | ThermoFisher | M2002-02 | |
| Qubit Assay Tubes | ThermoFisher | Q32856 | |
| Ion PI Foaming Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Index for barcoding of libraries | BaseCare | this is a in-house prepared index. Users can buy commercial product from ThermoFisher Ion Xpress Barcode Adapters Kits (Cat. No. 4474517) | |
| Ion PI Loading Buffer | ThermoFisher | A26772 | |
| Solid(TM) Buffer Kit-1X Low TE Buffer | ThermoFisher | 4389764 | |
| Agencour AMPure XP Kit | Beckman Coulter | A63880 | |
| DynaMag-2 magnet (magnetic rack) | ThermoFisher | 12321D | |
| Ion PI Master Mix PCR buffer | |||
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Micro 17 | 75002430 | |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9922 | This can be replaced by other brand. |
| PicoPLEX WGA Nuclease-free water | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Ion OneTouch Oil bottle | Ion PI Hi?Q OT2 Solutions 200 (Part No. A26429). Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| double-strand DNA standard | This is a in-house prepared DNA standard for calibration of Qubit before quantification of library. | ||
| PicoPLEX WGA Preamplification buffer | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| PicoPLEX WGA Preamplification enzyme | Rubicon Genomics | R30050 | This can be replaced by SurePlex DNA Amplification System,catalog number: PR-40-415101-03. |
| Library Amplification Primer Mix | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| Ion OneTouch Reaction Filter | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Recovery Router | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| Recovery Tubes | Extended kit component in Sheet 5 | ||
| ISP Resuspension Solution | |||
| Ion Proton | ThermoFisher | DA8600 | This model is imported by Da An Gene Co.,LTD. of Sun Yat-Sen University from ThermoFisher and has been certified by China Food and Drug Administration for clinical application. The catalog number in ThermoFisher is 4476610. |
| Ion PI Hi?Q Sequencing Polymerase | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI Sequencing Primer | |||
| server for sequencer | Lenovo | T260 | |
| Ion PI Sphere Particles | |||
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | ThermoFisher | 4471252 | |
| Nalgene 25mm Syringe Filters | ThermoFisher | 724-2045 | Pore size: 0.45μm. Specifically for aqueous fluids. |
| Ion PI Hi?Q W2 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion PI 1X W3 Solution | ThermoFisher | A26772 | |
| Ion OneTouch Wash Solution C1 | |||
| The Ion PGM Hi?Q View Sequencing Kit | ThermoFisher | A30044 | Extended kit component in Sheet 2 |
| Ion Plus Fragment Library Kit | ThermoFisher | 4471252 | Extended kit component in Sheet 3 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit (1 sequencing run per initialization) | ThermoFisher | A26772 | Extended kit component in Sheet 4 |
| Ion PI Hi?Q OT2 200 Kit | ThermoFisher | A26434 | Extended kit component in Sheet 5 |
References
- Balaban, B., Urman, B. Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation. Reproductive BioMedicine Online. 12 (5), 608-615 (2006).
- Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: An observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
- Magli, M. C., Gianaroli, L., Ferraretti, A. P.
- Trussler, J. L., Pickering, S. J., Ogilvie, C. M. Investigation of chromosomal imbalance in human embryos using comparative genomic hybridization. Reproductive BioMedicine Online. 8 (6), 701-711 (2004).
- Fragouli, E., et al. Cytogenetic analysis of human blastocysts with the use of FISH, CGH and aCGH: Scientific data and technical evaluation. Human Reproduction. 26 (2), 480-490 (2011).
- Calhaz-Jorge, C., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2013: Results generated from European registers by ESHRE. Human Reproduction. 32 (10), 1957-1973 (2017).
- Dyer, S., et al. International committee for monitoring assisted reproductive technologies world report: Assisted reproductive technology 2008, 2009 and 2010. Human Reproduction. 31 (7), 1588-1609 (2008).
- Dahdouh, E. M., Balayla, J., García-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: A meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
- Chen, M., Wei, S., Hu, J., Quan, S. Can Comprehensive Chromosome Screening Technology Improve IVF/ICSI Outcomes? A Meta-Analysis. PloS One. 10 (10), e0140779 (2015).
- Northrop, L. E., Treff, N. R., Levy, B., Scott, J. T. SNP microarray-based 24 chromosome aneuploidy screening demonstrates that cleavage-stage FISH poorly predicts aneuploidy in embryos that develop to morphologically normal blastocysts. Molecular Human Reproduction. 16 (8), 590-600 (2010).
- Barbash-Hazan, S., et al. Preimplantation aneuploid embryos undergo self-correction in correlation with their developmental potential. Fertility and Sterility. 92 (3), 890-896 (2009).
- Fragouli, E., et al. Comprehensive cytogenetic analysis of the human blastocyst stage. Fertility and Sterility. 90 (11), S36 (2008).
- Fiorentino, F., et al. Development and validation of a next-generation sequencing-based protocol for 24-chromosome aneuploidy screening of embryos. Fertility and Sterility. 101 (5), 1375-1382 (2014).
- Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical preimplantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).
- Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).
- Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencingplatforms: comparison of Ion Torrent, PacificBiosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 1-13 (2012).
- Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature Reviews Genetics. 17 (6), 333-351 (2016).
- Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for preimplantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).
- Harton, G. L., et al. ESHRE PGD Consortium/Embryology Special Interest Groupbest practice guidelines for polar body and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis/screening (PGD/PGS). Human Reproduction. 26 (1), 41-46 (2011).
- Liu, W. Q., et al. The performance of MALBAC and MDA methods in the identification of concurrent mutations and aneuploidy screening to diagnose beta-thalassaemia disorders at the single- and multiple-cell levels. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 32 (2), 1-8 (2018).
- Zhang, X., et al. The comparison of the performance of four whole genome amplification kits on ion proton platform in copy number variation detection. Bioscience Reports. 37 (4), BSR20170252 (2017).
- Munné, S., Grifo, J., Wells, D. Mosaicism: “survival of the fittest” versus “no embryo left behind”. Fertility and Sterility. 105 (5), 1146-1149 (2016).
- Del Carmen Nogales, M., et al. Type of chromosome abnormality affects embryo morphology dynamics. Fertility and Sterility. 107 (1), 229-235 (2017).
- Harton, G. L., et al. ESHRE PGD consortium best practice guidelines for amplification-based PGD. Human Reproduction. 26 (1), 33-40 (2011).
- Deleye, L., et al. Shallow whole genome sequencing is well suited for the detection of chromosomal aberrations in human blastocysts. Fertility and Sterility. 104 (5), 1276-1285 (2015).
- Bielanska, M., Tan, S. L., Ao, A. Chromosomal mosaicism throughout human preimplantation development in vitro: incidence, type, and relevance to embryo outcome. Human Reproduction. 17 (2), Oxford, England. 413-419 (2002).
- Treff, N. R., et al. Evaluation of targeted next-generation sequencing-based preimplantation genetic diagnosis of monogenic disease. Fertility and Sterility. 99 (5), 1377-1384 (2013).
