Summary
Здесь мы описываем метод для высокой разрешения замедленной многофотононной визуализации опухолевых клеток мозга до и после инвазивного хирургического вмешательства (например, биопсии) в рамках одного и того же живого животного. Этот метод позволяет изучать влияние этих инвазивных хирургических процедур на мигрирующие, инвазивные и пролиферативное поведение опухолевых клеток на одном клеточном уровне.
Abstract
Биопсия является стандартом ухода за лечением рака и клинически полезным, поскольку они позволяют твердых диагностики опухоли, прогноз, и персонализированные определения лечения. Однако возмущение опухолевой архитектуры биопсией и другими инвазивными процедурами было связано с нежелательным воздействием на прогрессирование опухоли, которое необходимо изучить в глубину для дальнейшего улучшения клинической пользы этих процедур. Обычные статические подходы, которые только обеспечивают снимок опухоли, ограничены в их способности выявить влияние биопсии на поведение опухолевых клеток, таких как миграция, процесс, тесно связанный с злокачественностью опухоли. В частности, миграция опухолевых клеток является ключом к очень агрессивным опухолям головного мозга, где локальное распространение опухоли делает полное резекцию опухоли практически невозможным. Развитие многофотонные изображения и хронические окна изображений позволяет ученым изучать этот динамический процесс у живых животных с течением времени. Здесь мы описываем метод продольной визуализации опухолевых клеток мозга с высоким разрешением до и после биопсии у одного и того же живого животного. Такой подход позволяет изучить влияние этой процедуры на поведение опухолевых клеток (миграция, вторжение и пролиферация). Кроме того, мы обсуждаем преимущества и ограничения этого метода, а также способность этой методологии изучать изменения в поведении раковых клеток для других хирургических вмешательств, включая резекцию опухоли или имплантацию химиотерапии .
Introduction
Стандарт ухода за большинством твердых опухолей включает в себя биопсиютканей для диагностики, прогноза и персонализированного определения лечения 1,2. В целом, эти процедуры дают клиническую пользу, но последние данные показывают, что биопсия и другие более инвазивные процедуры, такие как резекция опухоли, также может негативно влиять на прогрессирование опухоли3,4,5 , 6. Хотя эти процедуры остаются незаменимыми в стационарном уходе и их преимущества преодолевают их негативные последствия, необходимо в полной мере понять механизмы, лежащие в основе этих негативных последствий, с тем чтобы максимизировать безопасность пациентов и положительное влияние этих процедур и сделать их еще более клинически полезными.
Биопсия опосредованное нежелательное воздействие на прогрессирование опухоли вызвано системными изменениями и изменениями в микроокружении опухоли в ответ на нарушение тканей4,5. Таким образом, необходимо изучать этот процесс у живых животных. Однако, тонкие последствия этих минимально инвазивных процедур часто могут быть замаскированы большие различия между людьми. Обычные методы, основанные на иммуногистохимии или транскрипционном анализе экспрессии, могут игнорировать эти эффекты или требуют большого количества животных для их идентификации. Кроме того, эти статические подходы не имеют возможности выявлять изменения в поведении опухолевых клеток, такие как миграция и вторжение, динамические процессы, которые коррелируют с злокачественностью опухоли. Эти особенности опухолевых клеток имеют особое значение для очень агрессивных опухолей головного мозга, таких как глиобластома мультикварфа (GBM), где локальное распространение опухолевых клеток ограничивает хирургическую резекцию и снижает выживаемость пациента7. Чтобы в полной мере понять, как биопсия влияет на поведение клеток ГБМ, необходим продорок, позволяющий визуализировать эти клетки в физиологическом контексте живых организмов.
Недавнее развитие интражизненной визуализации высокого разрешения в сочетании с хирургически имплантированными хроническими окнамиизображений позволяет ученым изучать динамическое поведение опухолевых клеток у живых мышей в течение нескольких дней 8,9. Используя этот мощный подход, мы можем изучить, как размножаются, мигрируют и инфильтративного поведения опухолевых клеток в течение нескольких дней в ответ на биопсию в одной и той же мыши. По сравнению с другими методами, которые позволяют многодневный мониторинг опухолей у живых мышей, таких как магнитно-резонансная томография (МРТ)10, позитронно-эмиссионная томография / компьютерная томография (PET/CT)11, или биолюминесцентные изображения12, это подход однозначно предлагает возможность изучения поведения опухолевых клеток на уровне одной клетки и распутывание тонких изменений, происходящих в опухоли.
Здесь мы описываем подробный метод для выполнения биопсии, как травмы и до и постбиопсии продольной интражизненной визуализации в головном мозге опухолевых мышей. Этот метод потенциально может быть применен для изучения других хирургических вмешательств, таких как частичная резекция опухоли или имплантация химиотерапии.
Protocol
Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами Комитета по защите животных Королевской нидерландской академии искусств и наук(Нидерланды). Экспериментальные протоколы, используемые в этой рукописи, были одобрены Комиссаром Центрального Комиссара Дирпровена (CCD) и Instantie voor Dierenwelzijn (IvD).
1. Имплантация опухолевых клеток и подготовка окна черепной визуализации
- Хирургическая подготовка
- Используйте взрослых мышей (No gt;6 недель) любого штамма или пола. Саденьте мышь путем инъекций (флуанисон (нейролептик) и фентанил (опиоид) (0,4 мл/кг) - бензодиазепинское седативное (2 мг/кг) в дозе 1:1:2 в стерильной воде. Оцените состояние седации животного по щепотке.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе, как женщины, так и мужчины C57BL/6 мышей были использованы из-за того же генетического фона опухолевых клеток линии, используемой в этих экспериментах (GL261). Мышь будет оставаться полностью седативные для 1,5 ч. В качестве альтернативы, использовать ингаляционную анестезию, такие как изофлюран (1,5%-2% изофруран / O2 смеси). - Установите мышь на стереотаксическую раму и закрепите голову с помощью зажима носа и двух ушных брусков.
- Используйте нагревательную лампу для сохранения температуры тела. Отопительная лампа должна использоваться с осторожностью, в качестве альтернативы можно использовать водоциркиловые грелки.
- Нанесите глазную мазь, чтобы защитить роговицы мыши от высыхания.
- Используйте острые ножницы, чтобы побрить мех на черепе (область доза от глаз мыши до основания черепа) и дезинфицировать обнажённую кожу 70% этанола.
- Вырезать кожу в круговой манере с острыми ножницами и соскребать periosteum под с ватным тампоном. Нанесите каплю лидокаина 1% и эпинефрин 1:100,000 в течение 5 мин, и удалить избыток с ватным тампоном.
- Клей края кожи к черепу с cyanoacrylate клей.
- Поместите стереотаксическую раму под рассечение стерео микроскопа с 4x увеличением.
- Визуализируйте череп через микроскоп рассечения и сверлите круговой паз диаметром 5 мм над правой теменной костью. Выполните этот шаг осторожно и только поверхностно, избегая какого-либо давления на череп.
- Нанесите каплю буфера коры (125 мм NaCl, 5 мм KCl, 10 мМ глюкозы, 10 мМ HEPES буфер, 2 мМ MgSO4, и 2 мМ CaCl2 pH 7,4 ") и поднимите костной лоскут с помощью тонких щипц.
- Для следующих шагов, держать поверхность мозга покрыта буфером коры, если не указано иное.
- Под микроскопом вскрытия, визуализировать поверхность мозга и удалить dura mater с помощью изогнутых, конические, очень тонкой точки пинцета. Если кровотечение происходит на этом этапе, используйте поглощаемую губку желатина, чтобы остановить его.
- Используйте взрослых мышей (No gt;6 недель) любого штамма или пола. Саденьте мышь путем инъекций (флуанисон (нейролептик) и фентанил (опиоид) (0,4 мл/кг) - бензодиазепинское седативное (2 мг/кг) в дозе 1:1:2 в стерильной воде. Оцените состояние седации животного по щепотке.
- Инъекция опухолевых клеток
- Повторное увеличение желаемого количества флуоресцентных опухолевых клеток в 3 злител pbS (например, для экспериментов, показанных в этом протоколе, 1 х 105 GL261 клетки были введены).
ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как любой флуоресцентный маркер может быть использован, ядерный маркер настоятельно рекомендуется, чтобы отслеживать отдельные опухолевые клетки во время анализа. Кроме того, связанный с гистоном флуоресцентный маркер, такой как H2B, может быть использован для визуализации конденсации хромосом и, таким образом, для мониторинга деления клеток. Использование фото-переключатель маркера, таких как Dendra2, позволяет фотомаркировки и отслеживания опухолевых клеток в течение нескольких дней4,13. - Загрузите опухолевые клетки в газонепроницаемый шприц с иглой в стиле точки 2 и зафиксируйте его на руке стереотаксического манипулятора.
- Удалите буфер коры. Поместите кончик шприца в середине краниотомии и вставьте его на глубине 0,5 мм от поверхности черепа. Дополнительно, создать небольшое пространство в головном мозге для размещения суспензии опухолевых клеток. Для этого вставьте шприц на глубину до 1 мм, а затем извлеките его до 0,5 мм перед вбросом.
- Нанесите каплю буфера коры.
- Медленно введите клеточную суспензию с помощью инжектора насоса microsyringe (250-400 нл/мин). Удалите шприц и используйте поглощаемую желатиновую губку, чтобы остановить кровотечение, если это необходимо.
- Повторное увеличение желаемого количества флуоресцентных опухолевых клеток в 3 злител pbS (например, для экспериментов, показанных в этом протоколе, 1 х 105 GL261 клетки были введены).
- Подготовка окна черепной визуализации
- Удалите буфер коры и поместите каплю силиконового масла на участке краниотомии, чтобы избежать пузырьков воздуха под окном.
- Печать подвергаются мозга с 6 мм coverslip. Нанесите цианоакрилатный клей между крышкой и черепом. Аккуратно прижмите крышку к черепу с помощью тонкого пинцета, чтобы обеспечить минимальное расстояние между мозгом и крышкой.
- Нанесите зубной акриловый цемент на поверхность черепа, покрывая край крышки. Поместите тонкое кольцо из нержавеющей стали (1,5 мм внешнего диаметра, 1 мм внутреннего диаметра) вокруг краниотомии и дайте зубному цементу высохнуть. Дополнительно, добавить клей на границе, чтобы обеспечить кольцо на верхней части головы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта система фиксации головы является оптимальной для визуализации на перевернутом микроскопе: небольшие магниты, встроенные в коробку изображений, облегчают фиксацию окна черепа (CIW). В экспериментах, показанных в этом протоколе, использовался перевернутый микроскоп. Для вертикально микроскопов, фиксация может быть достигнута с помощью бара или кольца с канавками, которые могут быть прикреплены к микроскопу с помощью винтов или пластины, которая подходит кольцо. - Для лечения боли, ввести одну дозу 100 мкг / кг бупренорфин подкожно и позволяют животному восстановиться на грелке.
- Поместите мышь в отдельную клетку с измельченные бумаги для обогащения. Тщательно контролировать мышь ежедневно в течение первых нескольких дней и 2x в неделю, после этого, для нормального поведения, реактивности и внешнего вида.
2. Интравитальная визуализация
ПРИМЕЧАНИЕ: Временной интервал между инъекцией опухолевых клеток и первым сеансом интравитального изображения зависит от типа используемой линии опухолевых клеток. Для экспериментов, показанных в этом протоколе, 1x 105 GL261 клетки были введены и изображения 10 дней спустя.
- Подготовка изображений
- Сыграй мышь с помощью изофларановой ингаляционной анестезии через маску для лица (1,5%-2% изофларан/O2 смесь).
- Введите мышь подкожно с 100 л солей буфера для предотвращения обезвоживания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для долгосрочного изображения, мышь может быть гидратированных через подкожный инфузионный насос. - Поместите мышь лицом вверх в коробку изображений. Используйте металлическую пластину с отверстием диаметром 1 мм и небольшими магнитами, встроенными вокруг диафрагмы, чтобы обеспечить фиксацию CIW в коробке для визуализации. Ввести изофларан через маску и проветрить розетку на другой стороне коробки (0,8%-1,5% изолюран /O2 смеси). Дополнительно, используйте ленту, чтобы исправить тело мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентно помечены dextran для визуализации кровеносных сосудов или других красителей могут быть введены внутривенно в этой точке. - Дополнительно, используйте оксиметр импульса и нагревательный зонд для мониторинга жизненно важных моментов мыши.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте не было необходимости использовать оксиметр импульса и нагревательный зонд, так как мышь была стабильна на протяжении всего периода изображения (2–3 ч). Однако, для более длительного времени изображения, более тщательный мониторинг может быть необходимо. - Установите 25x (например, HCX IRAPO NA0.95 WD 2.5 мм) цель воды на самом низком z-позиции и добавить большую каплю воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование дозатора микро-погружения воды настоятельно рекомендуется для долгосрочных экспериментов, поскольку она позволяет ученым добавлять воду во время эксперимента. Кроме того, можно использовать сухую цель. - Перенесите коробку изображений на микроскоп, оснащенный темной климатической камерой, хранящейся при 37 градусах Цельсия. Принесите цель к крышке CIW до тех пор пока капля воды не коснется его.
- Используя режим эпифлюоресценции, наблюдать опухоль через окуляр и привлечь клетки в центре внимания.
- Приобретение изображения замедленного времени
- Выберите несколько позиций, представляющих интерес для изображения, и запишите их координаты в программном обеспечении. Убедитесь, что выбранные позиции являются репрезентативными позициями с разных участков опухоли (каждая опухоль может быть разной, но для обеспечения консистенции выберите одинаковое количество позиций, которые имеют центральное значение для ядра опухоли и краев всех мышей).
ПРИМЕЧАНИЕ: Сканирование плитки части опухоли или всей видимой опухоли может быть выполнено; однако, если опухоль большая, этот метод увеличит промежуток времени между изображениями. Кроме того, если опухолевые клетки движутся быстро, это может быть сложной задачей для отслеживания тех же клеток с течением времени. - Переключитесь на мультифотонный режим и настройте лазер на правильную длину волны. Обратите внимание, что, чтобы избежать фотоповреждения, более высокие длины волн желательно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации Dendra2 была использована длина волны 960 нм. С целью, используемой в этих экспериментах, зум 1,3 было достаточно, чтобы получить хорошее разрешение ядер опухоли и сканировать представительную область опухоли. - Перейдите в режим жизни и определите z-stack для каждой позиции, чтобы приобрести максимальный объем опухолевых клеток без ущерба для разрешения опухолевых клеток. Определите размер шага между изображениями как 3 мкм.
- Используйте двунаправленный режим для увеличения скорости сканирования. Разрешение изображения должно быть не менее 512 х 512 пикселей.
- Приобретайте изображения объема опухоли в разных положениях каждые 20 минут в течение 2 ч. Добавить воду к цели перед каждым приобретением изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Повремени изображения могут быть автоматически приобретены путем установки правильного промежуток времени в программном обеспечении. Тем не менее, мышь может двигаться, и положение или z-стек может сдвигаться с течением времени, вызывая потерю данных. Поэтому рекомендуется выполнять промежуток времени вручную и проверять и корректировать на xyz сдвиги между приобретениями. - На этом этапе, по желанию, фото-переключатель Dendra2 флуоресцентный маркер.
ПРИМЕЧАНИЕ: В отличие от замедленной визуализации (которая позволяет изучать индивидуальные свойства опухолевых клеток и как они меняются с течением времени), это позволит изучать область инфильтрации опухолевых клеток в головном мозге в течение нескольких дней4. Подробное объяснение этого шага описано Глигориевичем и др.13. - После того, как последнее изображение будет получено, снимите мышь со сцены и дайте ей восстановиться на грелке. Для предотвращения обезвоживания, 100 л солей может быть дано подкожно. Поместите мышь в клетку до тех пор, пока биопсия, как травмы выполняется.
- Выберите несколько позиций, представляющих интерес для изображения, и запишите их координаты в программном обеспечении. Убедитесь, что выбранные позиции являются репрезентативными позициями с разных участков опухоли (каждая опухоль может быть разной, но для обеспечения консистенции выберите одинаковое количество позиций, которые имеют центральное значение для ядра опухоли и краев всех мышей).
3. Биопсия, как травмы и CIW замены
- Создайте биопсию, как травмы на месте опухоли 1 день после первого сеанса изображения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кроме того, другая процедура, как частичное удаление опухоли, может быть выполнена.- Успокойте мышь с помощью изофлюранской ингаляционной анестезии, как описано ранее в шаге 2.1.1.
ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как инъекционные анестезии могут быть использованы, эта процедура короче, чем имплантация CIW, и ингаляционная анестезия позволяет точно контролировать и сократить время мыши остается седативным. - Поместите мышь на стереотаксической раме и закрепите ее голову двумя ушными прутьями и зажимом для носа. Проверьте глубину анестезии на отсутствие педалей рефлексов. Используйте маску для анестезии для стереотаксической хирургии, чтобы держать успокоительное мыши во время процедуры.
- Замочите ватный тампон в ацетоне и распределите его по краю крышки, чтобы смягчить клей, который держит крышку против мозга.
- Слайд тонкие щипточки точки под крышкой, чтобы поднять его. Если крышка ломается в этой точке, используйте щипцдляет, чтобы удалить куски стекла.
- Нанесите буфер коры, чтобы сохранить мозг влажным.
- Опустите 25 G иглы в опухоль на глубину 1 мм. Снимите иглу и остановить кровотечение, при необходимости, применяя желатин стерильной губки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть выполнен под флуоресцентным стереомикроскопом, чтобы более точно определить область опухоли (если опухоль слишком мала). Кроме того, во время прокола для определения биопсии может быть введен раствор флуоресцентного полистирола 1 мкм. - Запечатайте поверхность мозга силиконовым маслом и наклейте 6-мм крышку сверху.
- Успокойте мышь с помощью изофлюранской ингаляционной анестезии, как описано ранее в шаге 2.1.1.
4. Повторная визуализация
- Один день после нанесения биопсии, как травмы (и на последовательных дней, если это необходимо), повторить интравитетал изображения, как описано в шаге 2 выше, чтобы оценить, как поведение опухолевых клеток меняется с течением времени. Выберите несколько позиций опухоли, которые будут репрезентативными для всей области опухоли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если флуоресцентные бусы были использованы для идентификации биопсии области, локализовать их для изображения поведения опухолевых клеток в биопсии регионах по сравнению с не биопсии регионов.
5. Анализ изображений
- Если изображения замедленного исполнения данных были получены вручную, объедините их в одну папку.
- Откройте файл LIF замедленного действия в коммерческом программном обеспечении, связанном с микроскопом (например, LasX или LAS AF). Выберите вкладку Процесс (ru) и инструменты процесса (Ru) Выберите первое изображение последовательности времени и нажмите Первый. Выберите второе изображение последовательности времени и нажмите Второй. В измерениях слияниявыберите t для времени. Нажмите Применить. Будет создан новый файл с двумя тайм-пойнтами. Повторите этот процесс для всех тайм-пойнтов, используя вновь созданный файл в качестве первого изображения последовательности.
- Исправьте приобретенные z-стеки для любого сдвига xyz.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов, описанных в этом протоколе, специально разработанная программа Visual Basic была использована для коррекции. Кроме того, можно использовать другие доступные программы, такие как ImageJ или Imaris.- Экспорт файлов TIFF из программного обеспечения путем нажатия правого нажатия на объединенный файл замедленного времени. Выберите Сохранить данные RAW. Экспортированные файлы будут экспортироваться в одну папку, названную в соответствии с каналом, временем и z-position.
- Откройте файлы TIFF в специально разработанной программе Visual Basic.
- Определите количество таймтов, z-стеков и каналов.
- Присвоить цвет каждому каналу по порядку внешнего вида.
- В панели Form Show для каждого тайм-пойнта исправьте сдвиг в z, нажав на кнопки вверх (U) или вниз (D).
- В панели здания внутривратиального изображения выберите канал, который будет использоваться для коррекции для смещения xy. Выберите зеленый канал для коррекции, на основе сигнала от опухолевых клеток. Нажмите Автоматическая для коррекции xy.
- Экспорт исправленных изображений в качестве максимальной проекции трех последовательных z-стеков. В панели Выбор, ввести номера первого (Начало) и последний (Конец) z-ломтики для экспорта. Выберите Макса. Выберите отдельные папки для . Нажмите Ли. Для каждого из них три z-стеки, замедленного изображения будут экспортироваться в отдельную папку.
- Дополнительно, правильно для ткани упругой деформации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для экспериментов по деформации тканей, программное обеспечение компенсации движения соответствия было использовано для коррекции для жесткой и эластичной деформации ткани14. - Отслеживайте одиночные ячейки в полном z-stack в фильме замедленного просмотра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Опухолевые клетки можно отслеживать вручную, используя, например, плагин ImageJ (MTrackJ). Хотя это точно, это ограничивается xy плоскости и очень много времени. Кроме того, опухолевые клетки могут быть отслежены автоматически в течение всего z-объема, используя сегментацию опухолевых клеток (например, программное обеспечение Imaris). Однако при высокой плотности опухолей автоматизированное отслеживание менее точно и может привести к большим ошибкам отслеживания.- Откройте и отслеживайте каждую серию замедленного промежутков (в течение трех последовательных z-стеков) отдельно. Перетащите папку, содержащую изображения замедленного пребывания, в ImageJ.
- Выберите вкладку Плагины (ru) и слежения за мною (MtrackJ). Отслеживайте каждую отдельную ячейку, выбирая Добавить и нажав на каждую ячейку в каждую точку времени.
- Извлеките меру следов, нажав на Measure и сохраняя файл.
Representative Results
Чтобы оценить влияние биопсии на поведение опухолевых клеток мозга, мы выполнили процедуру, описанную в этом протоколе. Клетки глиомы-GL261, выражающие ядерный флуоресцентный белок (H2B-Dendra2), были введены в мозг мышей C57BL/6, и был имплантирован хронический CIW. Замедленное интравитевая визуализация была выполнена на том же животном до и пост-биопсии, как травмы опухоли(рисунок 1A, B). Миграция отдельных опухолевых клеток была определена путем отслеживания пути миграции с течением времени в различных плоскостях xy z-stack (рисунок1C) и построенв в процентах от мигрирующих клеток до и постбиопсии (рисунок 1F). Скорость пролиферации опухолевых клеток была количественно определена на основе конденсата Дендра2 с тегами H2B на митозе(рисунок 1D)и построена в процентах от деления клеток до и постбиопсии (рисунок1E). Мы сравнили распределение скорости миграции до и после биопсии в той же опухоли и обнаружили, что количество мигрирующих клеток (скорость юgt; 4 мкм/ч) увеличилось после вмешательства, с соответствующим уменьшением числа медленных/немиграторных клеток ( скорость злт; 4 мкм/ч)(рисунок 2A). В среднем на опухоль, мы наблюдали 1,75 (SD 0,16) -раз увеличение процента мигрирующих клеток, когда биопсии, как травмы были выполнены, по сравнению с контрольных мышей, которые не были биопсии(Рисунок 2B). Мы отслеживали поведение опухолевых клеток в течение еще одной недели и обнаружили, что, хотя процент мигрирующих опухолевых клеток в конечном итоге снизился как в контроле, так и в биопсии мышей, биопсии мышей по-прежнему выставлены более высокую мигрирующие возможности, чем контрольных мышей ( Рисунок 2С). Анализ пролиферативного поведения опухолевых клеток с течением времени показал 1,52 (SD 0,26) -раз увеличение числа митотических событий при биопсии, по сравнению с небиопсии контроля мышей (Рисунок 2D).
Чтобы проверить, является ли наблюдаемое воздействие биопсии на пролиферативное и миграционное поведение опухолевых клеток артефактом из-за операции по замене CIW (требуется для выполнения биопсии, как травмы), мы отслеживали поведение опухолевых клеток в группе мышей, которые прошли CIW замена без биопсии. В этой группе, мы не наблюдали каких-либо индукции миграции или пролиферации опухолевых клеток, указывая, что повышение пролиферации опухолевых клеток и миграции были специально вызваны биопсии, как травмы(рисунок 3A, B).
Стабильная фото-конвертируемость флуоресцентного белка Dendra2 позволяет изучать инфильтрацию опухолевых клеток в течение нескольких дней. При воздействии ультрафиолетового/синего света, Dendra2 необратимо переключается с зеленого на красный. Используя это свойство, квадратная область опухоли была освещена и 200 Dendra2-выражения опухолевых клеток были фото-отмечены до биопсии (Рисунок 4). На следующий день после биопсии мы переместили область фотопереключения и измерили объем опухолевых клеток, которые проникли в окружающие опухолевые ткани. Мы обнаружили, что область инфильтрации была в 1,72 (SD 0,41) раз больше в опухолях после биопсии, как травмы по сравнению с небиопсии контроля опухолей (Рисунок 4). Хотя этот подход предоставляет информацию только о опухолевых клеток навалом инфильтрационного поведения, а не на одном уровне клеток, это менее трудоемким, чем замедленной визуализации подход и может быть методом выбора для исследований вопросы сосредоточены исключительно на изучение инфильтрационного поведения.
Рисунок 1: Экспериментальная установка для продольной интравитальной визуализации эффекта биопсии на поведение опухолевых клеток. (A) Диаграмма, показывающая дизайн кольца и магнитного держателя. (B) Схематическое представление экспериментального рабочего процесса. Опухолевые клетки вводятся в мозг мышей и CIW устанавливается. При развитии опухоли проводится первый (пребиопсия) сеанс визуализации покадровой визуализации. На следующий день проводится биопсия и замена CIW. На следующий день после визуализации (постбиопсии) проводится второй сеанс визуализации замедленного времени. Для долгосрочных эффектов, последующие сеансы визуализации могут быть сделаны. (C) Изображения показывают репрезентативные снимки замедленного фильма, где GL261 H2B-Dendra2 опухолевые клетки были отслежены. Красные линии изображают отдельные опухолевые клетки треков. Шкала бар 50 мкм. (D) Представитель в vivo покадровой изображения отображения деления клеток в GL261 H2B-Dendra2 опухолей. Показаны различные стадии митоза: профаза (P), прометафа (ПМ), метафа (М), анафаза (А) и телофаза (Т). Шкала бар 50 мкм. Графики указывают процент (E) мигрирующих и (F) деления клеток до и постбиопсии. Каждая точка указывает процент мигрирующих клеток во всех положениях, измеренных в отдельном животном. Данные отображаются как средние s.E.M. шести мышей (яп. p'lt; 0.01, парный t-test). Эта цифра была изменена с Alieva и др.4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Репрезентативные результаты, показывающие влияние биопсии на миграцию опухолевых клеток и скорость распространения. (A) Водопад участки, показывающие изменение в распределении скорости клеток по отношению к базальной миграции у отдельных мышей. Данные отображаются как средние s.E.M. пяти мышей. (B) Количество мигрирующих клеток в контроле (синий) и биопсии (красный) животных нормализовались до числа мигрирующих клеток предварительного вмешательства (n No 6 мышей, P йlt; 0,0001, Студент т-тест). (C) Поведение опухолевых клеток отслеживалось в течение нескольких дней. Показаны нормализованные (относительно предварительного вмешательства) количество мигрирующих клеток у отдельных мышей с течением времени (n йgt; 4 мышей на состояние,P йlt; 0.0001, двусторонний ANOVA). (D) Нормализованное количество деленийных клеток в контроле (синий) и биопсии (красные) животных. На отдельное животное, значения послевмешательства были нормализованы к значениям preintervention(n q 5 мышей,p qlt; 0.01, Студенческая t-тест). Эта цифра была изменена с Alieva и др.4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Замена CIW не влияет на поведение опухолевых клеток. Продольная интравитальная визуализация показывает, что замена CIW без биопсии не влияет на темпы миграции и распространения. (A) Увеличение числа миграционных клеток для указанных условий. Каждый символ представляет собой среднее количество отдельной мыши, и nNo 4 мышей. (B) Увеличение числа размножающихся клеток для указанных условий. Каждый символ представляет собой среднее значение отдельной мыши (n No 4 мышей, p qlt; 0.01, 'P 'lt; 0.001, ns s s s s незначительное, одностороннее ANOVA с Newman-Keuls post hoc испытание). Эта цифра была изменена с Alieva и др.4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Диаграмма, показывающая экспериментальную установку и репрезентативные результаты, полученные при переключении фотографий Dendra2. Для мониторинга инфильтрации опухолевых клеток при биопсии, Dendra2-выражающих опухолевые клетки фото-переключены в квадратной области УФ / синий свет освещения и изображения, за день до биопсии. На следующий день после биопсии область переключения фото становится перелокализованной и переобраской. Показаны репрезентативные изображения Dendra2 инфильтрации опухолевых клеток, исправленные с помощью вычитания канала. Белая пунктирная линия представляет область проникновения. Бар шкалы 50 мкм. На графике показана увеличенная область переключения фото, отрисованные для биопсии (красных) и контрольных (голубых) мышей. Каждая точка представляет среднее значениеотдельной мыши (n 5 мышей,P qlt; 0,05, Студенческая t-test). Эта цифра была изменена с Alieva и др.4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Здесь мы описываем метод изучения изменений в поведении опухолевых клеток на уровне одной клетки в ответ на инвазивные хирургические процедуры, такие как биопсия, в мозге живого животного. Сочетание продольной мультифотонной визуализации с хирургической имплантацией хронического CIW позволяет количественно осваить миграцию опухолевых клеток, вторжение и пролиферацию до и после биопсии у одного и того же животного4. По сравнению с другими подходами, используемыми для мониторинга опухоли многодневного, таких как биолюминесцентные изображения12, МРТ10, или ПЭТ / КТ11, этот метод однозначно визуализирует опухоли на уровне одной клетки и, таким образом, обеспечивает понимание в клеточном поведении прогрессии опухоли.
Для успешного выполнения этого метода необходимо освоить несколько процедур. Наиболее важными шагами этого протокола являются имплантация и замена CIW. Техническая сложность этих шагов требует точности и хирургических навыков, которые могут быть приобретены с помощью постоянного обучения. Осложнения во время операции CIW, такие как кровотечение, которое может покрыть поверхность мозга, может оказаться сложной задачей для последующей визуализации. Отсутствие стерильных инструментов или окружающей среды, а также неспособность полностью запечатать поверхность мозга, может вызвать инфекцию на поверхности мозга (белая жидкость под крышкой), что сделает визуализацию проблематичной и сильно скомпрометирует полученное Интерпретации. Другой распространенной проблемой этого протокола является перемещение животных во время замедленной визуализации. Хотя любой сдвиг xyz может быть исправлен после эксперимента, рекомендуется исправить координаты каждой позиции перед каждой временной точкой, чтобы предотвратить потерю информации. Деформация тканей является дополнительной проблемой, найденной при визуализации на перевернутом микроскопе. Мозг ткани страдает от сжатия, когда мышь находится в положении на спине. В зависимости от степени деформации тканей, отслеживание опухолевых клеток может привести к ошибочной количественной оценке смещения клеток. Для предотвращения этого, программное обеспечение для жесткой и эластичной деформации могут быть использованы14.
Хотя эта процедура предлагает широкое применение для изучения изменений в поведении опухоли, определенные ограничения должны быть рассмотрены. Этот метод позволяет ученым изображение до глубины 1,6 мм (с использованием оптического параметрического осциллятора); однако, это означает, что изображение ограничено поверхностными участками коры головного мозга15. Таким образом, некоторые опухоли головного мозга, расположенные в глубоких структурах мозга, в том числе диффузные внутренние понтийские глиомы, расположенные в области ствола мозга, не могут быть изучены в их первоначальной среде мозга с помощью этого протокола. Еще одним ограничением этого протокола является объем опухоли, который можно сделать. Хотя общий объем сканирования опухоли желательно получить максимальную информацию, часто, размер опухоли и скорость мигрирующих клеток может быть ограничивающими факторами. Для каждого типа опухоли необходимо учитывать оптимальный промежуток времени для визуализации. Если временные рамки между изображениями слишком длинные, может быть трудно отследить опухолевые клетки. Использование резонансного сканера может значительно уменьшить время сканирования, что позволяет изображения больше опухоли16. Наконец, ручной анализ изображений этого протокола может занять очень много времени, поэтому вместо этого можно использовать программы для автоматического 3D-отслеживания. Тем не менее, результат отслеживания всегда должен быть визуально контролируется, так как алгоритмы автоматического отслеживания ячейки редко предназначены для точного повторения миграции ячеек, представляющих интерес.
Незначительная адаптация описанного здесь протокола может позволить еще более широкий спектр применений. Вместо проведения биопсии могут быть реализованы другие (хирургические) вмешательства, такие как частичная резекция опухоли или доставка химиотерапии вафель. Добавление соединений через хирургически имплантированную микротрубку может быть объединено с этим протоколом для фармакологического целевого конкретных молекул, представляющих интерес. Мы ожидаем, что эта модель будет полезна в исследованиях, направленных на анализ влияния определенного вмешательства на поведение опухолевых клеток. Возможность проведения повторных мер в одном животном не только дает более точные данные об изменениях, происходящих в опухоли, но и значительно уменьшает количество экспериментальных животных, необходимых для исследования.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Анко де Граафф и Центр визуализации Hubrecht за поддержку изображений и Эллен Веренс и Ханну Джонсон за коррективы и редактирование рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25g x 16 mm hypodermic needles | BD Microlance | 300600 | |
| 701 RN 10uL SYR W/O NEEDLE | Hamilton | 7635-01 | |
| Absorbable gelatin sponge | Pfizer | Gelfoam | |
| Coverslips round 6 mm | VWR international | 631-0168 | |
| Cyanoacrylate glue | Pattex | Pattex Ultra gel | |
| Dental cement | Vertex Dental | Vertex Self-Curing | |
| Drill | Dremel | Dremel 3000 (dental drill may be more convenient) + 105 Engraving Cutter | |
| Fine curved Tweezers | Dumont | AGT508 | |
| Hypnorm | VetaPharma Ltd | Hypnorm (Fentanyl citrate 0,315 mg/ml+ Fluanison 10 mg/ml) | |
| Midazolam | Actavis | Midazolam Actavis 5mg/ml | |
| Opthalmic ointment | Kela Veterinaria | Duodrops veter kela 10 m | |
| Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | |
| Silicone Oil | Sigma Aldrich | 181838 | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | Lab standard stereotaxic, rat and mouse | |
| Surgical stereo microscope | Olympus | ||
| Temgesic (0.3 mg/ml) | BD Pharmaceuticals | 283732 | |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Harvard Apparatus | 72-8508 | |
| Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) Local anesthetic | Astrazeneca | Xylocaine (Lidocaine 1% + Epinephrine 1:100,000) |
References
- Heuckmann, J. M., Thomas, R. K. A new generation of cancer genome diagnostics for routine clinical use: overcoming the roadblocks to personalized cancer medicine. Annals of Oncology. 26, 1830-1837 (2015).
- van Malenstein, H., et al. Histology obtained by needle biopsy gives additional information on the prognosis of hepatocellular carcinoma. Hepatology Research. 42, 990-998 (2012).
- Kretschmer, L., et al. High incidence of in-transit metastases after sentinel node biopsy in patients with melanoma (Br J Surg 2004; 91: 1370-1371). British Journal of Surgery. 92, 253-254 (2005).
- Alieva, M., et al. Preventing inflammation inhibits biopsy-mediated changes in tumor cell behavior. Scientific Reports. 7, 7529 (2017).
- Hobson, J., et al. Acute inflammation induced by the biopsy of mouse mammary tumors promotes the development of metastasis. Breast Cancer Research Treatment. 139, 391-401 (2013).
- Weil, S., et al. Tumor microtubes convey resistance to surgical lesions and chemotherapy in gliomas. Neuro-Oncology. 19, 1316-1326 (2017).
- Parsa, A. T., et al. Prognostic significance of intracranial dissemination of glioblastoma multiforme in adults. Journal of Neurosurgery. 102, 622-628 (2005).
- Zomer, A., et al. Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors. Stem Cells. 31, 602-606 (2013).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4, 158ra145 (2012).
- Schreurs, T. J., et al. Quantitative Multi-Parametric Magnetic Resonance Imaging of Tumor Response to Photodynamic Therapy. PLOS ONE. 11, e0165759 (2016).
- Nielsen, C. H., et al. PET imaging of tumor neovascularization in a transgenic mouse model with a novel 64Cu-DOTA-knottin peptide. Cancer Research. 70, 9022-9030 (2010).
- Alieva, M., et al. Glioblastoma therapy with cytotoxic mesenchymal stromal cells optimized by bioluminescence imaging of tumor and therapeutic cell response. PLOS ONE. 7, e35148 (2012).
- Gligorijevic, B., Kedrin, D., Segall, J. E., Condeelis, J., van Rheenen, J. Dendra2 photoswitching through the Mammary Imaging Window. Journal of Visualized Experiment. (28), e1278 (2009).
- Noordmans, H. J., Roode, R. d, Staring, M., Verdaasdonk, R. Registration and analysis of in vivo multispectral images for correction of motion and comparison in time. , Vol. 6081 PWB SPIE (2006).
- Kobat, D., Horton, N. G., Xu, C. In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex. Journal of Biomedical Optics. 16, 106014 (2011).
- Kirkpatrick, N. D., et al. Video-rate resonant scanning multiphoton microscopy: An emerging technique for intravital imaging of the tumor microenvironment. IntraVital. 1, (2012).
