Isolement, Propagation et Expression de la protéine Prion au cours de la différenciation neuronale de cellules souches humaines pulpe dentaire

Summary

Nous présentons ici un protocole pour humain isolement des cellules souches pulpe dentaire et propagation afin d’évaluer l’expression de la protéine prion au cours du processus de différenciation neuronale.

Abstract

Les enjeux éthiques associés à la manipulation des cellules souches embryonnaires ont entravé les progrès dans le domaine de la recherche médicale. Pour cette raison, il est très important d’obtenir des cellules souches adultes de différents tissus tels que les tissus adipeux, cordon ombilical, la moelle osseuse et le sang. Parmi les sources possibles, la pulpe dentaire est particulièrement intéressant parce qu’il est facile d’obtenir en ce qui concerne les considérations bioéthiques. En effet, Dental Pulp des cellules souches humaines (hDPSCs) sont un type de cellules souches adultes capables de se différencier en cellules neuronales semblables et peuvent provenir de la troisième molaire des patients en bonne santé (âgés de 13 à 19). En particulier, la pulpe dentaire a été enlevée avec une excavatrice, coupée en petites tranches, traitée par collagénase IV et cultivée dans un ballon jaugé. Pour induire la différenciation neuronale, hDPSCs ont été stimulées avec EGF/bFGF pendant 2 semaines. Auparavant, nous avons démontré qu’au cours du processus de différenciation de prion cellulaire protéine (PrP^C) en hDPSCs augmenté. L’analyse cytofluorométrique ont montré une expression précoce de la PrP^C qui a augmenté après le processus de différenciation neuronale. Ablation de la PrP^C de siARN PrP a empêché la différenciation neuronale induite par l’EGF/bFGF. Dans cet article, Nous illustrons que que nous avons amélioré l’isolement, de séparation et de méthodes de culture in vitro de hDPSCs avec plusieurs opérations simples, les clones de cellules plus efficaces étaient expansion obtenue et à grande échelle des cellules souches mésenchymateuses (CSM) a été observée. Nous montrons aussi comment les hDPSCs, obtenues avec les méthodes décrites dans le protocole, sont un excellent modèle expérimental pour étudier le processus de différenciation neuronale de MSCs et procédés cellulaires et moléculaires.

Introduction

Cellules souches mésenchymateuses ont été isolées de divers tissus, y compris la moelle osseuse, sang de cordon ombilical, pulpe dentaire humain, le tissu adipeux et sang^{1,2,3,4,5 , 6}. comme indiqué par plusieurs auteurs, hDPSCs montrent une adhésion en plastique, une morphologie typique des fibroblastes. Il s’agit d’une population très hétérogène avec des clones distincts et les différences dans la capacité de prolifération et de différenciation^7,8. hDPSCs expriment des marqueurs spécifiques des cellules souches mésenchymateuses (CD44, CD90, CD73, CD105, STRO-1), ils sont négatifs pour certains marqueurs hématopoïétiques (comme CD14 et CD19) et sont capables de différenciation multilignée in vitro^{9, 10,11}.

Plusieurs auteurs ont montré que ces cellules sont capables de se différencier en cellules de neurone comme utilisant des protocoles différents, qui comprennent l’ajout de NGF, bFGF, EGF en combinaison avec le spécifique médias et suppléments^7,12. En outre, beaucoup de protéines est impliquées au cours du processus de différenciation neuronale et, parmi ceux-ci, plusieurs journaux montre un rôle pertinent et une expression significative de la protéine prion cellulaire (PrP^C), aussi bien dans les cellules souches embryonnaires et adultes^{13, 14}. PrP^C représente une molécule pléiotrope capable de remplir des fonctions différentes à l’intérieur de cellules dans le métabolisme du cuivre, l’apoptose, et résistance à l’oxydation stress^{15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22}.

Dans notre précédente du livre²³, nous avons examiné le rôle de la PrP^C dans le processus de différenciation neuronale hDPSCs. En fait, hDPSCs exprimer précocement PrP^C et, après la différenciation neuronale, il était possible d’observer une augmentation supplémentaire. D’autres auteurs l’hypothèse d’un rôle possible de la PrP^C dans les processus de différenciation neuronale de cellules souches. En effet, PrP^C entraîne la différenciation des cellules souches embryonnaires humaines dans les neurones, les astrocytes et oligodendrocytes²⁴. Le but de cette étude était de mettre l’accent sur la méthodologie pour l’obtention de cellules souches de la pulpe dentaire, ses processus de différenciation et le rôle de la PrP^C au cours de la différenciation neuronale.

Protocol

Troisièmes molaires utilisés dans l’étude ont été excisés de patients (13-19 ans) avec aucun antécédent de consommation d’alcool ou de drogue, toutes non-fumeurs et avec une bonne hygiène buccale. Le jour de l’explication, au département de Science dentaire et maxillo-faciale de l’Université « La Sapienza » de Rome, le consentement éclairé a été obtenu depuis les patients ou les parents. Le consentement éclairé a été obtenu basée sur des considérations éthiques et à l’approbation du c…

Representative Results

Les procédures d’isolement et de séparation de hDPSCs de la pulpe dentaire, obtenue à partir de la troisième molaire, sont des processus complexes dans lesquels petits changements peuvent entraîner un résultat ruineux. Dans cet article, nous utilisons le protocole de Arthur et al. 12 avec plusieurs améliorations. Un schéma représentatif de procédures est illustré à la Figure 1. <p class="jove_content" fo:keep…

Discussion

Dans ce travail, nous nous sommes concentrés sur les méthodes d’isolement et de la différenciation neuronale de hDPSCs ; en outre, nous avons évalué le rôle de la PrP^C dans ce processus. Il y a plusieurs méthodes pour isoler et différencier hDPSCs en cellules semblables à des neurones et des étapes critiques au cours du processus. hDPSCs sont capables de se différencier en plusieurs lignées comme chondroblastes, adipocytes, ostéoblastes et neurones. Dans notre document, nous avons étudié les …

Materials

Amphotericin B solution	Sigma-Aldrich	A2942	It is use to supplement cell culture media, it is a polyene antifungal antibiotic from Streptomyce
Anti-B3tubulin	Cell Signaling Technology	#4466	One of six B-tubulin isoform, it is expressed highly during fetal and postnatal development, remaining high in the peripheral nervous system
Anti-CD105	BD Biosciences	611314	Endoglin (CD105), a major glycoprotein of human vascular endothelium, is a type I integral membrane protein with a large extracellular region, a hydrophobic transmembrane region, and a short cytoplasmic tail
Anti-CD44	Millipore	CBL154-20ul	Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells
Anti-CD73	Cell Signaling Technology	13160	CD73 is a 70 kDa glycosyl phosphatidylinositol-anchored, membrane-bound glycoprotein that catalyzes the hydrolysis of extracellular nucleoside monophosphates into bioactive nucleosides
Anti-CD90	Millipore	CBL415-20ul	Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells
Anti-GAP43	Cell Signaling Technology	#8945	Is a nervous system specific, growth-associated protein in growth cones and areas of high plasticity
Anti-mouse PE	Abcam	ab7003	Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis
Anti-NFH	Cell Signaling Technology	#2836	Is an antibody that detects endogenous levels of total Neurofilament-H protein
Anti-PrP mAb EP1802Y	Abcam	ab52604	Rabbit monoclonal [EP 1802Y] to Prion protein PrP
Anti-rabbit CY5	Abcam	ab6564	Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis
Anti-STRO 1	Millipore	MAB4315-20ul	Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells
B27 Supp XF CTS	Gibco by life technologies	A14867-01	B-27  can be used to support induction of human neural stem cells (hNSCs) from pluripotent stem cells (PSCs), expansion of hNSCs, differentiation of hNSCs, and maintenance of mature differentiated neurons in culture
BD Accuri C6 flow cytometer	BD Biosciences	AC6531180187	Flow cytometer equipped with a blue laser (488 nm) and a red laser (640 nm)
BD Accuri C6 Software	BD Biosciences		Controls the BD Accuri C6 flow cytometer system in order to acquire data, generate statistics, and analyze results
bFGF	PeproThec, DBA	100-18B	basic Fibroblast Growth Factor
Centrifuge CL30R	Termo fisher Scientific	11210908	it is a device that is used for the separation of fluids,gas or liquid, based on density
CO2 Incubator 3541	Termo fisher Scientific	317527-185	it ensures optimal and reproducible growth conditions for cell cultures
Collagenase, type IV	Life Technologies	17104019	Collagenase is a protease that cleaves the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-X-Glyc-Pro, which is found with high frequency in collagen
Disposable scalpel	Swann-Morton	501	It is use to cut tissues
DMEM-L	Euroclone	ECM0060L	Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose with L-Glutamine with Sodium Pyruvate
EGF	PeproThec, DBA	AF-100-15	Epidermal Growth Factor
Fetal Bovine Serum	Gibco by life technologies	10270-106	FBS is a popular media supplement because it provides a wide array of functions in cell culture. FBS delivers nutrients, growth and attachment factors and protects cells from oxidative damage and apoptosis by mechanisms that are difficult to reproduce in serum-free media (SFM) systems
Filtropur BT50 0.2,500ml Bottle top filter	Sarstedt	831,823,101	it is a device that is used for filtration of solutions
Flexitube GeneSolution for PRNP	Qiagen	GS5621	4 siRNAs for Entrez gene 5621. Target sequence N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA  N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA  N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA  N.4  CAGTGACTATGAGGACCGTTA
Hank's solution 1x	Gibco by life technologies	240200083	The essential function of Hanks′ Balanced Salt solution is to maintain pH as well as osmotic balance. It also provides water and essential inorganic ions to cells
HiPerFect Transfection Reagent	Qiagen	301705	HiPerFect Transfection Reagent is a unique blend of cationic and neutral lipids that enables effective siRNA uptake and efficient release of siRNA inside cells, resulting in high gene knockdown even when using low siRNA concentrations
Neurobasal A	Gibco by life technologies	10888022	Neurobasal-A Medium is a basal medium designed for long-term maintenance and maturation of pure post-natal and adult brain neurons
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	30525-89-4	Paraformaldehyde has been used for fixing of cells and tissue sections during staining procedures
penicillin/streptomycin	Euroclone	ECB3001D	It is use to supplement cell culture media to control bacterial contamination
Phosphate buffered saline  (PBS)	Euroclone	ECB4004LX10	PBS is a balanced salt solution used for the handling and culturing of mammalian cells. PBS is used to to irrigate, wash, and dilute mammalian cells. Phosphate buffering maintains the pH in the physiological range
TC-Platte 6 well, Cell+,F	Sarstedt	833,920,300	It is a growth surface for adherent cells
Tissue culture flask T-25,Cell+,Vented Cap	Sarstedt	833,910,302	Tissue culture flask T-25, polystyrene, Cell+ growth surface for sensitive adherent cells, e.g. primary cells, canted neck, ventilation cap, yellow, sterile, Pyrogen-free, non-cytotoxic, 10 pcs./bag
Triton X-100	Sigma-Aldrich	9002-93-1	Widely used non-ionic surfactant for recovery of membrane components under mild non-denaturing conditions
Trypsin-EDTA	Euroclone	ECB3052D	Trypsin will cleave peptides on the C-terminal side of lysine and arginine amino acid residues. Trypsin is used to remove adherent cells from a culture surface
Tube	Sarstedt	62,554,502	Tube 15ml, 120x17mm, PP
VBH 36 C2 Compact	Steril	ST-003009000	Offers totally protection for the enviroment and worker
ZEISS Axio Vert.A1 – Inverted Microscope	Zeiss	3849000962	ZEISS Axio Vert.A1 provides a unique entry level price and can provide all contrasting techniques, including brightfield, phase contrast, PlasDIC, VAREL, improved Hoffman Modulation Contrast (iHMC), DIC and fluorescence. Incorporate LED illumination for gentle imaging for fluorescently-labeled cells. Axio Vert.A1 is ergonomically designed for routine work and compact enough to sit inside tissue culture hoods.