我们描述了一种全面和实用的方法, 荧光恢复后的光漂白实验与活细胞。虽然该协议被用来测量黄色荧光蛋白标记 p62 在类似侵犯诱导结构中的流动性, 但它可以应用于各种显微镜系统和荧光蛋白。
光漂白 (FRAP) 后的荧光恢复是一种显微镜技术, 可用于量化活细胞中的蛋白质迁移率。在一个典型的 FRAP 实验中, 用低强度激光重复成像观察稳态荧光。随后, 荧光分子通过短暂暴露在高强度激光下, 受到迅速和不可逆转的损害。通过监测荧光的恢复, 获得了有关蛋白质流动性的信息。我们用 FRAP 测定了脂多糖 (LPS) 刺激小鼠巨噬细胞在侵犯性诱导结构 (ALIS) 中 p62 的流动性。由于许多现有的 FRAP 协议要么不完整, 要么很复杂, 所以我们的目标是为活细胞的 FRAP 实验提供一个全面、实用和直接的分步协议。在这里, 我们描述 RAW264.7 巨噬细胞转染与黄色荧光蛋白-p62 (YFP-62), 通过将细胞暴露在 LPS 中引入 alis, 以及收集预漂白剂和后漂白剂的 RAP 图像和数据分析的分步方法。最后, 我们讨论了在进行 FRAP 实验时需要考虑的重要因素。
光漂白 (frap) 后的荧光恢复是一种显微镜技术, 可用于量化活细胞1,2中的蛋白质动态。由于高分辨率、高速度和灵敏度的激光扫描共聚焦显微镜以及绿色荧光等基因编码荧光蛋白的 “彩虹”, FRAP 的普及程度有所提高蛋白质 (GFP) 和黄色荧光蛋白 (YFP)3。基因编码的荧光蛋白融合到感兴趣的蛋白质中, 以实现感兴趣的蛋白质的亚细胞定位。在一个典型的 FRAP 实验中, 通过用低强度激光重复成像该 ROI, 可以观察到细胞内感兴趣的采集区域 (ROI) 中的稳态荧光。随后, 荧光分子在预定义的采集 ROI 子集 (以下简称漂白剂 roi) 中受到快速且不可逆转的损害, 方法是短暂暴露于高强度激光。随着时间的推移, 新的未漂白蛋白质补充漂白蛋白质, 漂白 ROI 中荧光恢复的速度和强度提供了有关蛋白质流动性的信息 (图 1)4。
我们对确定泛素结合蛋白 62 (也称为固合物-1) 在小鼠 RAW264.7 巨噬细胞中的侵袭性诱导结构 (ALIS) 的流动性的兴趣, 导致我们回顾了 FRAP文学。不幸的是, 许多现有的 frap 协议不完整或过于复杂 5、6、7、8、9。有些没有提供有关激光设置、光束路径配置和图像采集参数5、6、7、8、9的详细信息。另一些人省略了有关数据分析的关键细节, 如如何解决漂白剂roi漂移6、9或如何计算重要的恢复参数, 包括移动分数 (mf)、不动分数(i) 和半场恢复 (t;半)5,7。相反, 另一些人过于强调用于计算 m f、if和t5、6、8、9的复杂数学公式.因此, 我们的目的是为活细胞的 FRAP 实验提供一个全面、实用和直接的分步协议。
我们为活细胞 FRAP 实验提供了一个全面、实用和简单的分步协议。在此, 该协议被用来测量 YFP-62 在刚刚264.7 巨噬细胞的 alis 中的流动性, 但它可以应用于许多激光扫描共聚焦显微镜系统和基因编码荧光蛋白, 这些系统和基因编码的荧光蛋白现已可用。对于任何显微镜系统, 试点实验对于确定最佳 FRAP 参数都至关重要, 包括采集、漂白剂和控制 ROI 大小、用于光漂白的激光强度以及预漂白和后漂白剂图像采集。对于每个基因编码的荧光蛋白和细胞系, 预计最佳 FRAP 参数会有所不同是合理的。
在进行 FRAP 实验时需要考虑的重要因素包括: (a) 达到适当的漂白剂深度, (b) 使用短暂的漂白剂步骤, (c) 让足够的时间后观察完全恢复功能, (d) 光漂白效率, (e)具有重复 FRAP 的细胞毒性, 以及 (f) 包括对重复成像引起的荧光损失的控制。我们建议漂白剂深度是≥90 13, 它可以根据3.3.1 部分提供的方程计算.当漂白剂深度 lt;90 时, 漂白剂后荧光恢复的程度会被低估, if、mf 和t半的值就不正确了。尽管在 FRAP 实验中, 诱导漂白剂的激光脉冲的持续时间和强度可能会有所不同, 但光漂白步骤的长度和速度必须比荧光恢复函数快很多。如果不是, 那么在漂白步骤中可能会发生大量的荧光恢复。在较长的漂白剂时间内, 在漂白步骤中不会测量荧光恢复, 并将导致对 if、mf 和t半的测量不正确。此外, 为了获得 if、mf 和t-半的正确值, 应观察获得后的 roi, 直到漂白剂 roi 中的荧光水平达到一个高原。例如, 在我们的 FRAP 实验中, 当我们在32.2分钟漂白剂的漂白剂中观察到 YFP-62 荧光时, 当我们在漂白剂 roi 中观察到 YFP-62 时, if、mf 和t半值之间没有差别15.1 分钟后漂白剂;因此, 我们的结论是, 恢复功能达到了高原在15.1 分后漂白剂12。在光漂白效率方面, 光漂白随光学变焦因子14的平方而增大。因此, 使用高光学变焦镜头有利于快速光漂白, 但在采集过程中可能会导致不良的光漂白;后者可以通过成像控制 ROI 来解释。重复的光漂白是要避免的, 因为它可以导致产生细胞毒性活性氧物种 (ROS)。然而, 基因编码荧光蛋白因暴露于高强度激光而产生的 ROS 的程度低于化学荧光 (如荧光抗体)15, 产生的 ros 更有可能发生反应在基因编码的荧光蛋白比与细胞4中的其他分子。除了产生细胞毒性 ROS 的概率增加外, 由于难以控制, 还应避免重复的光漂白。最后, 虽然使用低激光传输来获取所有非漂白剂图像, 但总会发生一些光漂白现象, 这一点必须得到控制。这方面可能的控制包括在获取 ROI 范围内监测控制 ROI 中的荧光, 在相邻的未漂白单元中获取控制图像, 以及对在光漂白实验, 但没有光漂白事件。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢芝加哥洛约拉大学的塞思·罗比亚博士对这份手稿的宝贵评论。国家卫生研究院向 Joanna c. Bakowska 提供1R01NS073967-01A1 的赠款, 支持了这项工作。
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Hyclone | SH30022.01 | High Glucose (4.5 g/L) |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
Glass bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-14-C | 35-mm |
Image J software | National Institutes of Health | N.A. | |
Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L4391 | |
Nocodazole | Sigma | M1404 | |
Penicillin-streptomycin solution | Corning | 30-002-Cl | 100× |
Plan-Apochromat 63×/1.40 oil objective | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | 4407629904000000 | |
Polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966-1 | linear (MW 25,000) |
RAW 264.7 murine macrophages | ATCC | TIB-71 | |
Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Inc | LSM 510 |