प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा झिल्ली रिसेप्टर्स के प्रसार और क्लस्टर आकार के विश्लेषण के लिए छवि प्रसंस्करण प्रोटोकॉल
Summary
यहां, हम एकल कण ट्रैकिंग छवि विश्लेषण है कि प्रसार गुणांक, गति और एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाया कणों के क्लस्टर आकार के प्रकार के मात्रात्मक मूल्यांकन की अनुमति देता है के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।
Abstract
कण एक वीडियो अनुक्रम पर नज़र रखने और उनके प्रक्षेप के पीछे विश्लेषण आजकल कई जैविक अध्ययनों में एक आम ऑपरेशन है । एक मॉडल के रूप में सेल झिल्ली रिसेप्टर क्लस्टर्स के विश्लेषण का उपयोग करना, हम इस छवि विश्लेषण कार्य के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल वर्तमान फिजी का उपयोग कर (ImageJ) और Matlab दिनचर्या के लिए: 1) ब्याज और डिजाइन इन क्षेत्रों के लिए अनुकूलित मास्क के क्षेत्रों को परिभाषित; 2) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी वीडियो में कणों को ट्रैक; 3) चयनित पटरियों के प्रसार और तीव्रता विशेषताओं का विश्लेषण. प्रसार गुणांक का मात्रात्मक विश्लेषण, गति के प्रकार, और क्लस्टर आकार प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और छवि प्रसंस्करण द्वारा प्राप्त एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करने के लिए चाहिए निर्धारित कण गतिशीलता और संशोधित करने के परिणाम पर्यावरण की स्थिति । इस लेख में हम इन सुविधाओं के विश्लेषण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । यहां वर्णित विधि न केवल एकल अणु ट्रैकिंग का पता लगाने की अनुमति देता है, लेकिन यह भी कोशिका झिल्ली पर पार्श्व प्रसार मापदंडों का अनुमान automates, प्रक्षेपवक्र के प्रकार वर्गीकृत और पूरा विश्लेषण इस प्रकार पर काबू पाने की अनुमति देता है सेल झिल्ली पर अपने पूरे प्रक्षेपवक्र पर हाजिर आकार बढ़ाता में कठिनाइयों ।
Introduction
लिपिड बिलयर में एम्बेड किए गए झिल्ली प्रोटीन थर्मल विसरण के कारण लगातार आवाजाही में हैं । उनकी गतिशीलता के लिए सेल प्रतिक्रियाओं को विनियमित आवश्यक हैं, के रूप में अंतराआण्विक बातचीत परिसरों कि मोनोमर से oligomers के आकार में बदलती है और संकेतन परिसरों की स्थिरता को प्रभावित करने की अनुमति देते हैं । प्रोटीन गतिशीलता को नियंत्रित करने के तंत्र को स्पष्ट करना इस प्रकार सेल जीव विज्ञान में एक नई चुनौती है, संकेत पारक्रमण रास्ते को समझने के लिए और अप्रत्याशित सेल कार्यों की पहचान करने के लिए आवश्यक है ।
कुछ ऑप्टिकल विधियों को जीवित कोशिकाओं1में इन बातचीत का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है । इन के अलावा, कुल आंतरिक परावर्तन प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी, 1980 के दशक में विकसित की है, पर या बहुत सेल झिल्ली2के पास आणविक बातचीत के अध्ययन की अनुमति देता है । जीवित कोशिकाओं में TIRF डेटा से प्राप्त झिल्ली प्रोटीन प्रक्षेपणों के गतिशील मापदंडों का अध्ययन करने के लिए, एक एकल कण ट्रैकिंग विधि (SPT) की आवश्यकता है । हालांकि कई एल्गोरिदम इस के लिए उपलब्ध हैं, हम वर्तमान में jaqaman एट अल.3 द्वारा प्रकाशित उन का उपयोग करें कि पता कण गति विविधता एक घने कण क्षेत्र में लगातार फ्रेम के बीच कणों को जोड़ने के लिए परिणामी ट्रैक कनेक्ट द्वारा खंडों में पूर्ण प्रक्षेप पथ (अस्थाई कण गायब) । सॉफ्टवेयर कण विलय और बंटवारे कि एकत्रीकरण और वियोजन घटनाओं3से परिणाम पर कब्जा । इस सॉफ्टवेयर के आउटपुट डेटा में से एक पूरे प्रक्षेपवक्र के साथ कणों का पता लगाने के प्रत्येक फ्रेम में अपने एक्स और वाई पदों को परिभाषित कर रहा है ।
एक बार कणों का पता चला रहे हैं, हम कम timelag प्रसार गुणांक (डी1-4)4,5का निर्धारण करने के लिए विभिन्न एल्गोरिदम लागू होते हैं । पल स्केलिंग स्पेक्ट्रम (MSS)6,7,8 विश्लेषण लागू करके या वक्र9के लिए मतलब वर्ग विस्थापन (msd) के समायोजन द्वारा ‘ अल्फा ‘ मूल्य फिटिंग करके, हम भी अनुसार कणों को वर्गीकृत प्रक्षेप पथ का प्रकार ।
प्रतिदीप्ति छवियों में हाजिर तीव्रता का विश्लेषण10,11क्षेत्र में वैज्ञानिकों के लिए एक साझा उद्देश्य है । सबसे आम इस्तेमाल किया एल्गोरिथ्म तथाकथित संख्या और चमक है । यह विधि फिर भी मोबाइल अंश में कणों में सही फ़्रेम-दर-फ़्रेम तीव्रता का पता लगाने की अनुमति नहीं देता है । हम है, इस प्रकार, एक नया एल्गोरिथ्म इन कण तीव्रता फ्रेम-दर-फ्रेम का मूल्यांकन करने के लिए और उनके एकत्रीकरण राज्य का निर्धारण करने के लिए उत्पंन । एक बार प्रत्येक कण के निर्देशांक U-Track2 सॉफ्टवेयर3का उपयोग कर का पता लगाया है, हम प्रत्येक फ्रेम में अपनी तीव्रता को परिभाषित पूरा प्रक्षेपवक्र पर, भी खाते में प्रत्येक फ्रेम में सेल पृष्ठभूमि ले रही है । इस सॉफ्टवेयर अलग संभावनाएं प्रदान करता है स्पॉट तीव्रता और सेल पृष्ठभूमि का निर्धारण करने के लिए और, संदर्भ के रूप में ज्ञात एकलक और dimeric प्रोटीन का उपयोग कर, कण में प्रोटीन की अनुमानित संख्या की गणना (क्लस्टर आकार) का पता लगाया ।
इस आलेख में, हम इन तीन चरणों को पूरा करने के लिए एक सावधानीपूर्वक मार्गदर्शिका का वर्णन करते हैं: 1) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके यू-ट्रैक के वीडियो के साथ एकल कणों का पता लगाना और ट्रैकिंग करना; 2) तात्कालिक प्रसार गुणांक (डी1-4) उन कणों का विश्लेषण और आंदोलन के प्रकार (सीमित, नि: शुल्क, या निर्देशित) द्वारा लंबे प्रक्षेप के साथ कणों की MSS; 3) प्रत्येक स्थान के लिए अनुमानित पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति द्वारा सही वीडियो के साथ हाजिर तीव्रता को मापने. यह क्लस्टर आकार अनुमान और photoब्लीचिंग चरणों की पहचान की अनुमति देता है ।
इस प्रोटोकॉल के उपयोग के लिए विशेष कौशल की आवश्यकता नहीं है और कोशिका संस्कृति, प्रवाह cytometry और माइक्रोस्कोपी सुविधाओं के साथ किसी भी प्रयोगशाला में किया जा सकता है । प्रोटोकॉल ImageJ या फिजी का उपयोग करता है (ImageJ12का एक वितरण), U-ट्रैक3, और कुछ तदर्थ मेड दिनचर्या (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip) । यू ट्रैक और तदर्थ दिनचर्या मतलब है कि किसी भी संगत कंप्यूटर में स्थापित किया जा सकता है पर चलाते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्णित विधि भी किसी भी पिछले Matlab के साथ काम कर रहे अनुभव के बिना प्रदर्शन करने के लिए आसान है । हालांकि, Matlab दिनचर्या विभिंन आज्ञाओं का नामकरण और विभिंन कार्यक्रम द्वारा नियोजित फ़ोल्डर्स के स्थानीयकरण ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उनकी मदद और प्रसार गुणांक विश्लेषण के स्रोत कोड के लिए कार्लो Manzo और मारिया García प्लाजो के लिए आभारी हैं । इस काम के भाग में विज्ञान, नवाचार और विश्वविद्यालयों (SAF 2017-82940-R) और instituto डी सैलड कार्लोस III के रेटिक्स कार्यक्रम के मंत्रालय से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (RD12/0009/009 और RD16/0012/0006; आरआईईआर) । LMM और जेवी Fundación जनरल CSIC के COMFUTURO कार्यक्रम द्वारा समर्थित हैं ।
Materials
| Human Jurkat cells | ATCC | CRL-10915 | Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software |
| pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP | Clontech | 632469 | Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine |
| Gene Pulse X Cell electroporator | BioRad | We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells. Use the transfection method best working in your hands. | |
| Cytomics FC 500 flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required. You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest. | |
| Dako Qifikit | DakoCytomation | K0078 | Used for quantification the number of receptors in the cell surface. |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek corporation | P35G-1.5-10-C | |
| Human Fibronectin from plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Recombinant human CXCL12 | PeproTech | 300928A | |
| Inverted Leica AM TIRF | Leica | ||
| EM-CCD camera | Andor | DU 885-CSO-#10-VP | |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | ||
| U-Track2 software | Danuser Laboratory | ||
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| FiJi | FiJI | https://imagej.net/Fiji) | |
| u-Track2 software | Matlab tool. For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice | ||
| GraphPad Prism | GraphPad software |
Referências
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