Elaborazione di protocollo per l'analisi della diffusione e dimensione dei Cluster di recettori di membrana mediante microscopia a fluorescenza
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per singola particella monitoraggio analisi delle immagini che permette la valutazione quantitativa dei coefficenti di diffusione, tipi di movimento e cluster di dimensioni delle singole particelle rilevate mediante microscopia a fluorescenza.
Abstract
Monitoraggio su una sequenza video e l’analisi posteriore dei loro traiettorie delle particelle al giorno d’oggi sono un’operazione comune a molti studi biologici. Utilizzando l’analisi del ricevitore della membrana cellulare cluster come un modello, vi presentiamo un protocollo dettagliato per questa attività di analisi di immagine utilizzando Fiji (ImageJ) e routine di Matlab per: 1) definire le aree di interesse e progettare maschere adattate a queste regioni; 2) traccia le particelle in video microscopia di fluorescenza; 3) analizzare le caratteristiche di diffusione e l’intensità dei brani selezionati. I tipi di movimento e la dimensione dei cluster, analisi quantitativa dei coefficienti di diffusione ottenuta mediante microscopia a fluorescenza ed elaborazione di immagini fornisce un valido strumento per determinare oggettivamente particelle dinamiche e le conseguenze della modifica condizioni ambientali. In questo articolo presentiamo protocolli dettagliati per l’analisi di queste caratteristiche. Il metodo descritto qui non solo permette la rilevazione di rilevamento di singola molecola, ma consente anche di automatizzare la stima dei parametri di diffusione laterale alla membrana delle cellule, classifica il tipo di traiettoria e consente analisi completa superando così il Difficoltà a quantificare la dimensione dello spot sulla sua intera traiettoria alla membrana delle cellule.
Introduction
Proteine di membrana incorporati nel bilayer del lipido sono in continuo movimento a causa di diffusione termica. Le dinamiche sono essenziali per regolare le risposte cellulari, come interazioni intermolecolari permettono la formazione di complessi che variano nel formato da monomeri di oligomeri e influenzare la stabilità di complessi di segnalazione. Chiarire i meccanismi che controllano la dinamica della proteina è dunque una nuova sfida in biologia cellulare, necessaria per comprendere le vie di trasduzione del segnale e per identificare le funzioni delle cellule imprevisti.
Alcuni metodi ottici sono stati sviluppati per lo studio di queste interazioni in vivo le cellule1. Tra questi, microscopia a fluorescenza (TIRF) riflessione interna totale, sviluppata nei primi anni 1980, permette lo studio delle interazioni molecolari o molto vicino alla membrana cellulare2. Per studiare i parametri dinamici di traiettorie di proteine di membrana ottenuti dai dati di TIRF in cellule viventi, una singola particella inseguimento del metodo (SPT) è richiesta. Anche se diversi algoritmi sono disponibili per questo, utilizziamo attualmente quelli pubblicati da Jaqaman et al.3 che indirizzo eterogeneità di movimento delle particelle in un campo di particelle dense collegando particelle tra fotogrammi consecutivi per collegare la traccia risultante segmenti in traiettorie complete (scomparsa temporanea delle particelle). Il software acquisisce la particella Unione e divisione di quel risultato da aggregazione e dissociazione eventi3. Uno dei dati di output di questo software è rilevamento delle particelle lungo l’intera traiettoria definendo le posizioni X e Y in ogni fotogramma.
Una volta che le particelle vengono rilevate, applichiamo diversi algoritmi per determinare l’intervallo breve diffusione coefficiente (D1-4)4,5. Applicando l’analisi di8 7,6,momento Scaling spettro (MSS) o inserendo il valore di ‘alpha’ di regolazione della cilindrata di Mean Square (MSD) alla curva9, classifichiamo anche le particelle secondo il tipo di traiettoria.
Analisi di spot intensità nelle immagini di fluorescenza sono un obiettivo condiviso per gli scienziati nel campo10,11. L’algoritmo più comune utilizzato è il cosiddetto numero e luminosità. Questo metodo tuttavia non consente rilevamento corretto frame-by-frame intensità in particelle nella frazione del mobile. Abbiamo, quindi, generato un nuovo algoritmo per valutare queste particelle intensità frame-by-frame e per determinare il loro stato di aggregazione. Una volta le coordinate di ogni particella vengono rilevate utilizzando U-Track2 software3, definiamo la sua intensità in ogni fotogramma sopra la traiettoria completa, tenendo conto anche lo sfondo della cella in ogni fotogramma. Questo software offre diverse possibilità per determinare l’intensità di spot e lo sfondo della cella e, utilizzando proteine note monomeriche e dimeriche come riferimenti, calcola il numero approssimativo delle proteine della particella rilevato (dimensione del cluster).
In questo articolo, descriviamo una guida attenta per eseguire questi tre passi: 1) rilevazione e monitoraggio delle singole particelle lungo un video di microscopia di fluorescenza usando U-traccia; 2) analizzare il coefficente di diffusione istantanea (D1-4) di quelle particelle e al tipo di movimento (confinato, gratuito o diretto) di particelle con lunghe traiettorie di MSS; 3) misurando l’intensità posto lungo il video rettificato da fluorescenza di fondo stimato per ogni spot. Questo consente di stima delle dimensioni cluster e identificazione dei passaggi photobleaching.
L’utilizzo di questo protocollo non richiede competenze specialistiche e può essere eseguita in qualsiasi laboratorio con coltura cellulare, strutture di microscopia e citometria di flusso. Il protocollo utilizza ImageJ o Fiji (una distribuzione di ImageJ12), U-traccia3e alcune routine di hoc fatta di annuncio (http://i2pc.es/coss/Programs/protocolScripts.zip). U-traccia e ad hoc routine eseguite su Matlab che può essere installato in qualsiasi computer compatibile.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo descritto è facile da eseguire anche senza avere alcuna precedente esperienza di lavoro con Matlab. Tuttavia, la routine di Matlab estremamente richiedono precisione con la nomenclatura dei comandi diversi e la localizzazione delle diverse cartelle impiegato dal programma. Di rilevamento routine di analisi (passaggio 3), più parametri possono essere modificati. La finestra “Impostazione gaussiana-miscela modello raccordo” (punto 3.8) controlla come U-traccia rileverà singole particelle sul video. Questo vien…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a Carlo Manzo e Maria García Parajo per la loro guida e il codice sorgente dell’analisi del coefficiente di diffusione. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni dal Ministero spagnolo della scienza, innovazione e Università (SAF 2017-82940-R) e il programma RETICS dell’Instituto de salud Carlos III (RD12/0009/009 e RD16/0012/0006; RIER). LMM e JV sono supportati dal programma COMFUTURO del CSIC Fondazione generale.
Materials
| Human Jurkat cells | ATCC | CRL-10915 | Human T cell line. Any other cell type can be analyzed with this software |
| pAcGFPm-N1 (PT3719-5)DNA3GFP | Clontech | 632469 | Different fluorescent proteins can be followed and analyzed with this routine |
| Gene Pulse X Cell electroporator | BioRad | We use 280V, 975 mF, for Jurkat cells. Use the transfection method best working in your hands. | |
| Cytomics FC 500 flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| MoFlo Astrios Cell Sorter | Beckman Coulter | Depending on the level of transfection, cell sorting may not be required. You can also employ cells with stable expression of adequate levels of the receptor of interest. | |
| Dako Qifikit | DakoCytomation | K0078 | Used for quantification the number of receptors in the cell surface. |
| Glass bottom microwell dishes | MatTek corporation | P35G-1.5-10-C | |
| Human Fibronectin from plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Recombinant human CXCL12 | PeproTech | 300928A | |
| Inverted Leica AM TIRF | Leica | ||
| EM-CCD camera | Andor | DU 885-CSO-#10-VP | |
| MATLAB | The MathWorks, Natick, MA | ||
| U-Track2 software | Danuser Laboratory | ||
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| FiJi | FiJI | https://imagej.net/Fiji) | |
| u-Track2 software | Matlab tool. For installing, download .zip file from the web page (http://lccb.hms.harvard.edu/software.html) and uncompress the file in a directory of your choice | ||
| GraphPad Prism | GraphPad software |
Referências
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