Materiaal vorming van recombinant spin Silks door waterige oplosmiddel met behulp van warmte en druk
Summary
Hier presenteren we een protocol voor de productie van water oplosbare recombinant Spider Silk Protein Solutions en de materiële vormen die kunnen worden gevormd uit deze oplossingen.
Abstract
Veel spinnen produceren zeven soorten Silks. Zes van de zijdes zijn vezel in vorm wanneer geproduceerd door de spinnen. Deze vezels zijn niet in water oplosbaar. Om de opmerkelijke mechanische eigenschappen van spin zijdes te reproduceren, moeten zij in heterologe gastheren worden geproduceerd aangezien de spinnen zowel territoriaal als kannibalistische zijn. De synthetische analogen van spin zijde ook de neiging om onoplosbaar zijn in waterige oplossingen. Zo, een groot percentage van het onderzoek in recombinant spin zijdes vertrouwen op organische oplosmiddelen die schadelijk zijn voor grootschalige productie van materialen. De methode van onze groep dwingt de Solvatie van deze recombinante spin zijdes in water. Opmerkelijk is, wanneer deze eiwitten zijn bereid met behulp van deze methode van warmte en druk, een breed scala van materiële vormen kunnen worden bereid uit dezelfde oplossing van recombinant Spider Silk eiwitten (rSSp), waaronder: films, vezels, spons, hydrogel, lyogel, en lijmen. Dit artikel toont de productie van solvated rSSp en materiële vormen op een manier die gemakkelijker dan van geschreven materialen en methodes alleen wordt begrepen.
Introduction
Spider Silks hebben garnered het belang van materiële wetenschappers voor hun indrukwekkende combinatie van kracht, elasticiteit, en biocompatibiliteit. Recreëren van vezels is van oudsher de stuwkracht van het onderzoek. Deze inspanning werd belemmerd door de recombinante spin zijde proteïne (rSSp) onoplosbaarheid in water evenals het onvermogen van traditionele solvation technieken (chaotropic agenten en detergentia) om waterige oplosbaarheid te bereiken. Verder, technieken die zijn ontwikkeld voor solvating versies van rSSp werken niet op alle rSSp varianten en vereisen ook aanzienlijke manipulatie en tijd die vaak resulteert in eiwitverlies1,2. Dit heeft grotendeels geresulteerd in het gebied gebruik te maken van 1, 1, 1, 3, 3, 3-hexafluoroisopropanol (HFIP) als een oplosmiddel van waaruit vezels te vormen, en andere beperkte materiële vormen. Het voordeel is dat alle bekende rSSp oplosbaar zijn in HFIP, waardoor de gegevens uniformiteit tussen elke onderzoeksgroep wordt verschaft. Het nadeel is dat HFIP is een giftig oplosmiddel dat is duur en onpraktisch om de schaal als gevolg van gezondheidsproblemen en milieu-overwegingen.
Een nieuwe benadering van rSSp solvation werd ontwikkeld die de technologische kloof overbrugde tussen de harde organische oplosmiddel HFIP en andere technieken die selectief werkte voor rSSp solvation. De combinatie van specifieke warmte en druk werd toegepast op suspensies van rSSp en water. De resultaten waren dichtbij 100% solvation en terugwinning van rSSp, evenals hoge eiwit concentraties; een verscheidenheid van materialen vormen werden bepaald om van deze formuleringen mogelijk te zijn die niet allen haalbaar waren gebruikend HFIP of andere organische oplosmiddelen3,4,5,6. Het doel van deze aanpak is om efficiënt en gemakkelijk solubilize gezuiverde en gedroogde recombinante spin-eiwitten in een waterige oplossing die vervolgens kan worden gebruikt voor de productie van een verscheidenheid van materiële vormen.
Vezels, films, coatings, lijmen, hydrogels, lyogels, microsferen, en spons materialen zijn allemaal gemakkelijk te verwezenlijken uit dezelfde waterige rSSp oplossing met behulp van deze methode. De verdere evolutie van deze methode, niet alleen met extra rSSp maar met andere proteïnen, kon tot nieuwe materiële vormen en alternatieve EiwitReiniging en oplosbaar maken wegen leiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Na recombinant spin zijde eiwitten worden gezuiverd moeten ze dan worden voorbereid in een oplossing die kan worden gebruikt voor de materiële vorming. Door het mengen van gelyofiliseerde Spider Silk Protein met water en het blootstellen van dit mengsel aan magnetron bestraling, om warmte en druk te genereren, het mogelijk om een rSSp oplossing te bereiden. Een grote verscheidenheid van materiële vormen kan worden geproduceerd uit deze eenvoudige en efficiënte methode van rSSp oplosbaar maken. Elk materiaal moet uniek…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen dankbaar te erkennen financiering van de Utah Science and Technology Research (USTAR) initiatief.
Materials
| 3 mL Syringe with Luer-Lok Tip | BD | 309657 | Other size syringes can be used but to keep the tips on, it is advised to use luer-lok tips |
| 4 mL culture vial, clear with rubber lined cap | Wheaton | 225142 | Minimum dope volume is 1mL, max is 2mL |
| 8 mL culture vial, clear with rubber lined cap | Wheaton | 225144 | Minimum dope volume is 2mL, max is 4mL |
| 99% Isopropyl Alcohol, Reagent ACS/USP Grade | Pharmco-Aaper | 231000099 | |
| Freezone 4.5 Plus | Labconco | 7386030 | Freeze Dryer |
| Luer Adapter Female Luer x 10-32 Female, Tefzel (ETFE) | IDEX | P-629 | |
| Microwave | Magic Chef | HMD1110B | 120V, 60Hz AC; 1000 watts; 1.1 cu. ft. capacity; with glass turn table |
| One-Piece Fingertight 10-32 Coned, for 1/16" OD | IDEX | F-120X | |
| PEEK Tubing 1/16" OD x 0.010" ID | IDEX | 1531B | |
| Sprayer: Master Airbrush | Master Airbrush | TC-60 |
Referências
- Huemmerich, D., et al. Primary Structure Elements of Spider Dragline Silks and Their Contribution to Protein Solubility. Bioquímica. 43 (42), 13604-13612 (2004).
- Schacht, K., Scheibel, T. Controlled Hydrogel Formation of a Recombinant Spider Silk Protein. Biomacromolecules. 12 (7), 2488-2495 (2011).
- Jones, J. A., et al. More Than Just Fibers: An Aqueous Method for the Production of Innovative Recombinant Spider Silk Protein Materials. Biomacromolecules. 16 (4), 1418-1425 (2015).
- Tucker, C. L., et al. Mechanical and Physical Properties of Recombinant Spider Silk Films Using Organic and Aqueous Solvents. Biomacromolecules. 15 (8), 3158-3170 (2014).
- Harris, T. I., et al. A Sticky Situation: An Investigation of Robust Aqueous-Based Recombinant Spider Silk Protein Coatings and Adhesives. Biomacromolecules. 17 (11), 3761-3772 (2016).
- Jones, J. A., et al. Importance of Heat and Pressure for Solubilization of Recombinant Spider Silk Proteins in Aqueous Solution. International Journal of Molecular Sciences. 17 (11), 1955 (2016).
- Copeland, C. G., Bell, B. E., Christensen, C. D., Lewis, R. V. Development of a Process for the Spinning of Synthetic Spider Silk. ACS Biomaterials Science and Engineering. 1 (7), 557-584 (2015).
- Arcidiacono, S., et al. Aqueous Processing and Fiber Spinning of Recombinant Spider Silks. Macromolecules. 35 (4), 1262-1266 (2002).
- Work, R. W. Mechanisms of Major Ampullate Silk Fiber Formation by Orb-Web-Spinning Spiders. Transactions of the American Microscopical Society. 96 (2), 170-189 (1977).
- Decker, R. E., et al. Method for the Destruction of Endotoxin in Synthetic Spider Silk Proteins. Scientific Reports. 8 (12166), 1-6 (2018).
