Zuivering en transplanteren van Myogenic Progenitor cel afgeleid Exosomes ter verbetering van de hartfunctie bij Duchenne Muscular Dystrofe muizen
Summary
Hier presenteren we een protocol om Transient hartfunctie bij Duchenne spierdystrofie muizen door exosomes afgeleid van normale myogenic voorlopercellen verplanten.
Abstract
Duchene Muscular Dystrophy (DMD) is een X-gebonden recessieve genetische ziekte die wordt veroorzaakt door een gebrek aan functionele Dystrofine-eiwit. De ziekte kan niet worden genezen, en naarmate de ziekte vordert, ontwikkelt de patiënt symptomen van verwijde cardiomyopathie, aritmie en congestief hartfalen. De DMDMDX mutant muizen doen niet express Dystrofine en worden vaak gebruikt als een muismodel van DMD. In onze recente studie, die we hebben vastgesteld dat intramyocardial injectie van brede type (WT)-myogenic voorlopercellen cellen afkomstige exosomes (MPC-Exo) Transient hersteld de uitdrukking van Dystrofine in het myocardium van DMDMDX mutant muizen, die werd geassocieerd met een tijdelijke verbetering van de hartfunctie suggereren dat kan WT-MPC-Exo bieden een optie voor het verlichten van de cardiale symptomen van DMD. Dit artikel beschrijft de techniek van MPC-Exo-zuivering en transplantatie in het hart van DMDMDX mutant muizen.
Introduction
Duchenne muscular dystrophy (DMD) is een X-gebonden recessieve, progressieve neuromusculaire ziekte veroorzaakt door een mutatie in gen DMD en het verlies van functionele Dystrofine1. Dystrofine voornamelijk in skeletspieren en myocard wordt uitgedrukt, en minder wordt uitgedrukt in gladde spieren, endocriene klieren en neuronen2,3. DMD is de meest voorkomende vorm van spierdystrofie met een incidentie van één per 3.500 tot 5.000 pasgeboren jongens wereldwijd4,5. Individuen ontwikkelen meestal progressieve spier necrose, verlies van onafhankelijke wandelen door vroege adolescentie, en dood in de decennia van de tweede naar de derde van hun leven als gevolg van hartfalen en respiratoir falen6.
Verwijde cardiomyopathie, aritmieën en congestief hartfalen zijn gemeenschappelijke cardiovasculaire uitingen van DMD7,8. De ziekte kan niet worden genezen, ondersteunende behandeling kan symptomen verbeteren of vertragen van de progressie van hartfalen, maar het is heel moeilijk om het hart functie9,10.
Soortgelijk aan DMD patiënten, spierdystrofie X-gebonden (MDX) muizen hebben een tekort in het Dystrofine-eiwit en huidige symptomen van cardiomyopathie11, en worden daarom veel gebruikt bij DMD verbonden cardiomyopathie onderzoek. Om te herstellen van Dystrofine in betrokken spieren, heeft allogene stamcel therapie bewezen een effectieve behandeling voor DMD12,13,14. Exosomes, 30-150 nm membraan blaasjes uitgescheiden door verschillende celtypes, spelen een sleutelrol in de cel-naar-cel communicatie via genetische materiaal vervoer, zoals messenger-RNA (mRNA) en niet-coderende RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.
Onze vorige studies hebben aangetoond dat exosomes afgeleid van myogenic voorlopercellen (MPC), zoals C2C12 cellijn, Dystrofine kunt overbrengen mRNA naar host cardiomyocytes na directe cardiale injectie22, waarmee wordt aangegeven dat allogene levering van MPC-afgeleide exosomes (MPC-Exo) kunt Transient DMD genexpressie in MDX-muizen herstellen. Dit artikel richt zich op de zuivering en -transplantatie technieken MPC-Exo.
Protocol
Representative Results
Discussion
De methode van het isoleren van pure exosomes is essentieel voor de studie van de functie van exosomes. Een van de gebruikte technieken voor exosome isolatie is polyethyleen glycolen (pinnen) gemedieerde neerslag17,18,25. Exosomes kunnen worden neergeslagen in haringen en Ingehuld door lage snelheid centrifugeren. PEG-gemedieerde zuivering is erg handig, goedkope, hoeft niet alle geavanceerde apparatuur, maar er bestaat bezorgdh…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tang werden slechts gedeeltelijk ondersteund door de American Heart Association: GRNT31430008 NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.
Materials
| 0.22-μm Filter | Fisherbrand | 09-720-004 | |
| 15-cm Cell Culture Dish | Thermo Fisher Scientific | 157150 | |
| 24-gauge catheter | TERUMO | SR-OX2419CA | |
| 31-gauge insulin needle | BD | 328291 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | AAJ19943K2 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| 6-0 suture | Pro Advantage by NDC | P420697 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Anti-Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | |
| Antigen retriever | Aptum Biologics | R2100-US | Antigen recovery |
| Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 | |
| C2C12 cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Centrifuge | Unico | C8606 | |
| Change-A-Tip High Temp Cauteries | Bovie Medical Corporation | HIT | |
| Confocal microscopy | Zeiss | Zeiss 780 Upright Confocal | |
| DBA/2J-mdx mice | The Jackson Laboratory | 013141 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| Goat serum | MP Biomedicals, LLC | 191356 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Ketamine | Henry Schein | 056344 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Mouse Retractor Set | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Rodent ventilator | Harvard Apparatus | 55-7066 | |
| SW-28 Ti rotor | Beckman | 342207 | |
| The Vevo 2100 Imaging Platform | FUJIFILM VisualSonics | Vevo 2100 | Ultrasound System |
| Ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
| Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344058 | |
| Xylazine (XylaMed) | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 1XYL003 8XYL006 |
Referências
- Yiu, E. M., Kornberg, A. J. Duchenne muscular dystrophy. Journal of Paediatrics and Child Health. 51 (8), 759-764 (2015).
- Nudel, U., et al. Duchenne muscular dystrophy gene product is not identical in muscle and brain. Nature. 337 (6202), 76-78 (1989).
- Rae, M. G., O’Malley, D. Cognitive dysfunction in Duchenne muscular dystrophy: a possible role for neuromodulatory immune molecules. Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1304-1315 (2016).
- Mah, J. K., et al. A systematic review and meta-analysis on the epidemiology of Duchenne and Becker muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (6), 482-491 (2014).
- D’Amario, D., et al. A current approach to heart failure in Duchenne muscular dystrophy. Heart. 103 (22), 1770-1779 (2017).
- Koeks, Z., et al. Clinical Outcomes in Duchenne Muscular Dystrophy: A Study of 5345 Patients from the TREAT-NMD DMD Global Database. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (4), 293-306 (2017).
- Kamdar, F., Garry, D. J. Dystrophin-Deficient Cardiomyopathy. Journal of the American College of Cardiology. 67 (21), 2533-2546 (2016).
- Wang, Z., et al. Regenerative Therapy for Cardiomyopathies. Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).
- Fayssoil, A., Nardi, O., Orlikowski, D., Annane, D. Cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy: pathogenesis and therapeutics. Heart Failure Reviews. 15 (1), 103-107 (2010).
- Hagan, M., Ashraf, M., Kim, I. M., Weintraub, N. L., Tang, Y. Effective regeneration of dystrophic muscle using autologous iPSC-derived progenitors with CRISPR-Cas9 mediated precise correction. Medical Hypotheses. 110, 97-100 (2018).
- Quinlan, J. G., et al. Evolution of the mdx mouse cardiomyopathy: physiological and morphological findings. Neuromuscular Disorders. 14 (8-9), 491-496 (2004).
- Siemionow, M., et al. Creation of Dystrophin Expressing Chimeric Cells of Myoblast Origin as a Novel Stem Cell Based Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy. Stem Cell Reviews and Reports. 14 (2), 189-199 (2018).
- Sienkiewicz, D., Kulak, W., Okurowska-Zawada, B., Paszko-Patej, G., Kawnik, K. Duchenne muscular dystrophy: current cell therapies. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 8 (4), 166-177 (2015).
- Zhang, Y., et al. Long-term engraftment of myogenic progenitors from adipose-derived stem cells and muscle regeneration in dystrophic mice. Human Molecular Genetics. 24 (21), 6029-6040 (2015).
- Ju, C., et al. Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes for Angiogenesis. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 429-437 (2018).
- Ju, C., et al. Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Promotes Repair in Ischemic Myocardium. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 420-428 (2018).
- Ruan, X. F., et al. Suxiao Jiuxin pill promotes exosome secretion from mouse cardiac mesenchymal stem cells in vitro. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 569-578 (2018).
- Ruan, X. F., et al. Exosomes from Suxiao Jiuxin pill-treated cardiac mesenchymal stem cells decrease H3K27 demethylase UTX expression in mouse cardiomyocytes in vitro. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 579-586 (2018).
- Chen, Y., Tang, Y., Fan, G. C., Duan, D. D. Extracellular vesicles as novel biomarkers and pharmaceutic targets of diseases. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 499-500 (2018).
- Chen, Y., Tang, Y., Long, W., Zhang, C. Stem Cell-Released Microvesicles and Exosomes as Novel Biomarkers and Treatments of Diseases. Stem Cells International. 2016, 2417268 (2016).
- Murphy, C., et al. Emerging role of extracellular vesicles in musculoskeletal diseases. Molecular Aspects of Medicine. 60, 123-128 (2018).
- Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).
- Hu, G., et al. Exosome-mediated shuttling of microRNA-29 regulates HIV Tat and morphine-mediated neuronal dysfunction. Cell Death & Disease. 3, 381 (2012).
- Bayoumi, A. S., et al. A carvedilol-responsive microRNA, miR-125b-5p protects the heart from acute myocardial infarction by repressing pro-apoptotic bak1 and klf13 in cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 72-82 (2018).
- Wang, Y., et al. Exosomes/microvesicles from induced pluripotent stem cells deliver cardioprotective miRNAs and prevent cardiomyocyte apoptosis in the ischemic myocardium. International Journal of Cardiology. 192, 61-69 (2015).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).
- Oksvold, M. P., Neurauter, A., Pedersen, K. W. Magnetic bead-based isolation of exosomes. Methods in Molecular Biology. 1218, 465-481 (2015).
- Pedersen, K. W., Kierulf, B., Neurauter, A. Specific and Generic Isolation of Extracellular Vesicles with Magnetic Beads. Methods in Molecular Biology. 1660, 65-87 (2017).
- Teng, X., et al. Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Improve the Microenvironment of Infarcted Myocardium Contributing to Angiogenesis and Anti-Inflammation. Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (6), 2415-2424 (2015).
- Aminzadeh, M. A., et al. Exosome-Mediated Benefits of Cell Therapy in Mouse and Human Models of Duchenne Muscular Dystrophy. Stem Cell Reports. 10 (3), 942-955 (2018).
