Identificatie van Nucleollaire factoren tijdens de HIV-1-replicatie via Rev-immunoprecipitatie en massaspectrometrie

Summary

Hier beschrijven we Rev immunoprecipitatie in de aanwezigheid van HIV-1 replicatie voor massaspectrometrie. De beschreven methoden kunnen worden gebruikt voor de identificatie van nucleollaire factoren die betrokken zijn bij de HIV-1-infectieuze cyclus en zijn van toepassing op andere ziekte modellen voor de karakterisering van onderbestudeerde trajecten.

Abstract

De HIV-1 infectieuze cyclus vereist virale eiwit interacties met gastheerfactoren om virale replicatie te vergemakkelijken, verpakking, en vrijlating. De infectieuze cyclus verder vereist de vorming van virale/gastheer eiwitcomplexen met HIV-1-RNA te reguleren van de splicing en het inschakelen van nucleocytoplasmorische transport. Het HIV-1 rev-eiwit bereikt de nucleaire export van HIV-1 Mrna’s door middel van multimerisatie met intronic CIS-acteer doelen-het Rev Response element (RRE). Een nucleolar lokalisatie signaal (NoLS) bestaat binnen het COOH-eindpunt van de Rev arginine-Rich motief (ARM), waardoor de accumulatie van Rev/RRE complexen in de Nucleolus. Nucleollaire factoren worden gespeculeerd ter ondersteuning van de HIV-1-infectieuze cyclus door middel van verschillende andere functies naast het bemedieren van mRNA-onafhankelijke nucleaire export en splicing. We beschrijven een immunoprecipitatie methode van wild-type (WT) Rev in vergelijking met Rev nucleolar mutaties (deletie en single-point Rev-NoLS mutaties) in de aanwezigheid van HIV-1 replicatie voor massaspectrometrie. Nucleollaire factoren die betrokken zijn bij het nucleocytoplasminezuur transport (nucleophosmin B23 en nucleolin C23), evenals cellulaire splicing factoren, verliezen interactie met Rev in de aanwezigheid van Rev-NoLS mutaties. Verschillende andere nucleollaire factoren, zoals snoRNA C/D Box 58, zijn geïdentificeerd om interactie met Rev-mutaties te verliezen, maar hun functie in de HIV-1-replicatiecyclus blijft onbekend. De hier gepresenteerde resultaten tonen het gebruik van deze aanpak voor de identificatie van virale/host-nucleollaire factoren die de HIV-1-infectieuze cyclus behouden. De begrippen die in deze benadering worden gebruikt, zijn van toepassing op andere virale en ziekte modellen die de karakterisering van onderbestudeerde trajecten vereisen.

Introduction

De Nucleolus wordt gepostuleerd als de interactie grond van verschillende cellulaire host en virale factoren die nodig zijn voor virale replicatie. De Nucleolus is een complexe structuur onderverdeeld in drie verschillende compartimenten: het fibrillar compartiment, het dichte fibrillar compartiment en het granulaire compartiment. Het HIV-1 rev-eiwit lokaliseert specifiek binnen korrelvormige compartimenten; echter, de reden voor dit lokalisatie patroon is onbekend. In aanwezigheid van éénpunts mutaties binnen de NoLS sequentie (Rev mutaties 4, 5 en 6), handhaaft Rev een nucleolar patroon en is eerder aangetoond dat het HIV-1_HXB2 replicatie moet redden, maar met een verminderde efficiëntie vergeleken met WT Rev¹ . Alle éénpuntmutaties zijn niet in staat om de HIV-1_NL4-3 infectieuze cyclus te ondersteunen. In de aanwezigheid van meerdere éénpunts mutaties binnen de NoLS sequentie (Rev-NoLS mutaties 2 en 9), is Rev waargenomen om te dispergeren in de Nucleus en het cytoplasma en heeft het niet kunnen redden van HIV-1_HXB2 replicatie¹. Het doel van deze proteomica studie is het ontcijferen van nucleollaire en niet-nucleollaire cellulaire factoren die betrokken zijn bij de Rev-mediated HIV-1 infectieuze pathway. Rev immunoprecipitatie voorwaarden worden geoptimaliseerd door interactie met de nucleolar B23 fosfoproteïne, die eerder is aangetoond dat het verliezen van interactie met Rev in de aanwezigheid van nucleollaire mutaties.

Rev cellulaire factoren zijn uitgebreid bestudeerd in het verleden; Dit is echter gebeurd bij afwezigheid van virale pathogenese. Een eiwit, in het bijzonder, dat wordt gekenmerkt in deze studie door middel van Rev interactie tijdens HIV-1 replicatie is de nucleolar fosfoprotein B23-ook wel nucleophosmin (NPM), numatrin, of NO38 in amfibieën^{2,3, 4}. B23 wordt uitgedrukt als drie isovormen (NPM1, NPM2, en NPM3)-alle leden van de nucleophosmin/nucleoplasmin nucleaire chaperonne familie^5,6. De NPM1 moleculaire chaperonne functies in de juiste assemblage van nucleosomes, in de vorming van eiwitten/nucleïnezuur complexen die betrokken zijn bij chromatine hogere orde structuren^7,8, en in de preventie van aggregatie en het verkeerd vouwen van doel eiwitten via een N-terminaal kern domein (residuen 1-120)⁹. NPM1 functionaliteit strekt zich uit tot ribosoom Genesis door het transport van preribosomale deeltjes tussen de Nucleus en cytoplasma^10,11, de verwerking van preribosomale RNA in de interne getranscribeerde spacer sequentie ^12,13, en het arresteren van de nucleollaire aggregatie van eiwitten tijdens de ribosomale assemblage^14,15. NPM1 is betrokken bij de remming van apoptosis¹⁶ en in de stabilisatie van tumor suppressors ARF^17,18 en p53¹⁹, onthullen zijn dubbele rol als een oncogene factor en tumor suppressor. NPM1 neemt deel aan de cellulaire activiteiten van genoom stabiliteit, centrosoom replicatie, en transcriptie. NPM1 is gevonden in nucleoli tijdens celcyclus Interphase, langs de chromosomale periferie tijdens mitose, en in prenucleolar lichamen (PNB) aan het einde van de mitose. NPM2 en NPM3 zijn niet zo goed bestudeerd als NPM1, die ondergaat veranderde expressieniveaus tijdens maligniteiten²⁰.

NPM1 is gedocumenteerd in de nucleocytoplasmische pendelen van verschillende nucleaire/nucleollaire eiwitten via een interne NES en nls^9,21 en werd eerder gerapporteerd aan de nucleaire import van HIV-1 tat en Rev eiwitten rijden. In aanwezigheid van B23-bindende-Domain-β-galactosidase fusie eiwitten, TAT mislocaliseert binnen het cytoplasma en verliest trans activatie activiteit; Dit toont een sterke affiniteit van TAT voor B23². Een andere studie vestigde een Rev/B23 stabiel complex in de afwezigheid van RRE-bevattende Mrna’s. In aanwezigheid van RRE mRNA, Rev dissocieert van B23 en bindt bij voorkeur aan de HIV RRE, wat leidt tot de verplaatsing van B23²². Het is niet bekend waar, op het subnucleaire niveau, TAT trans activatie en de Rev Exchange process van B23 voor HIV mRNA plaatsvinden. Beide eiwitten zijn gepostuleerd om gelijktijdig via B23-interactie de Nucleolus binnen te gaan. De betrokkenheid van andere cellulaire eiwitten van de host in de HIV-nucleollaire pathway wordt verwacht. De in dit Proteomica-onderzoek beschreven methoden zullen helpen om het samenspel van de Nucleolus met gastheer cellulaire factoren die betrokken zijn bij HIV-1-pathogenese te verhelden.

Het Proteomica onderzoek werd geïnitieerd door de uitdrukking van Rev nols single-point mutaties (M4, M5 en M6) en meerdere arginine substituties (m2 en M9) voor HIV-1_HXB2 productie. In dit model is een HeLa-cellijn dat stabiel de Rev-deficiënte HIV-1_HXB2 (hlfb) UITDRUKT met WT rev en Rev nucleolar mutaties met een flag tag op het 3 ‘ einde. De aanwezigheid van WT Rev zorgt ervoor dat virale replicatie plaatsvindt in de HLfB-cultuur, in vergelijking met Rev-NoLS-mutaties die geen Rev-deficiëntie (m2 en M9) redden, of toestaan dat virale replicatie plaatsvindt, maar niet zo efficiënt als WT Rev (M4, M5 en M6)¹. Het celllysaat wordt 48 h later verzameld na virale proliferatie in aanwezigheid van Rev expressie en onderworpen aan immunoprecipitatie met een lysisbuffer geoptimaliseerd voor rev/B23 interactie. Lysis buffer optimalisatie met behulp van variërende zoutconcentraties wordt beschreven, en eiwit elutie methoden voor HIV-1 rev worden vergeleken en geanalyseerd in zilver gebeitst of Coomassie-gekleurd SDS-PAGE gels. De eerste proteomica-benadering omvat de directe analyse van een geeluteerde steekproef van geuite WT Rev, m2, M6 en M9 door massaspectrometrie met tandem. Een tweede benadering waarbij de eluaten van WT Rev, M4, M5 en M6 een gel-extractieproces onderging, wordt vergeleken met de eerste benadering. Peptide affiniteit met Rev-NoLS mutaties in vergelijking met WT Rev wordt geanalyseerd en de eiwit identificatie waarschijnlijkheid weergegeven. Deze benaderingen onthullen mogelijke factoren (nucleolar en nonnucleolar) die deelnemen aan HIV-1 mRNA transport en splicing met Rev tijdens HIV-1 replicatie. In het algemeen zijn de beschreven cellysis, IP-en elutie-omstandigheden van toepassing op virale eiwitten die van belang zijn voor het begrijpen van cellulaire factoren van de host die infectieuze trajecten activeren en reguleren. Dit is ook van toepassing op de studie van cellulaire gastheerfactoren die nodig zijn voor de persistentie van verschillende ziekte modellen. In dit proteomica-model is HIV-1 rev-IP geoptimaliseerd voor B23-interactie om nucleollaire factoren te verhelden die betrokken zijn bij nucleocytoplasmorische pendelen activiteit en HIV-1 mRNA-binding. Bovendien kunnen cellijnen die stabiel zijn voor infectieuze ziekte modellen die een tekort hebben aan belangrijke eiwitten van belang, worden ontwikkeld, vergelijkbaar met de HLfB-cellijn, om infectieuze trajecten van belang te bestuderen.

Protocol

1. celcultuur Handhaaf hlfb in het gemodificeerde eagle’s medium (DMEM) van Dulbecco aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mm L-glutamine en 1 mm natrium pyruvaat binnen met weefselcultuur behandelde 100 mm platen. Houd de celculturen bij 37 °C in een bevoficeerde incubator die wordt geleverd met 5% CO2. Passage confluente cellen naar een celdichtheid van 1 x 106 cellen/ml. Gooi de celkweek media weg. Spoel de cellen voorzichtig af met 10 mL 1x fosfaat-gebufferde zoutop…

Representative Results

Rev-NoLS single-en multiple-Point arginine mutaties, overeenkomend met een verscheidenheid van subcellulaire lokalisatie patronen, werden onderzocht in hun vermogen om te communiceren met cellulaire host factoren in vergelijking met WT Rev. WT Rev-3’vlag en pcDNA-Flag vector werden uitgedrukt in de HLfB-cultuur. Eiwitcomplexen werden verwerkt uit het totale cellysaat en gekleurd met Zilvervlek reagens. Rev-NoLS-3’flag is detecteerbaar (ongeveer 18 kDa) in drie verschillende lysisbuffer condities met verschillend…

Discussion

Massaspectrometrische analyses met vergelijking van Rev-NoLS-mutaties en WT Rev in de aanwezigheid van HIV-1 werden beoordeeld om te begrijpen welke nucleollaire factoren betrokken waren bij de virale replicatiecyclus. Dit zou nucleollaire componenten identificeren die nodig zijn voor virale infectiviteit. Nucleollaire B23 heeft een hoge affiniteit met Rev-NoLS en functies in de nucleollaire lokalisatie van Rev³ en nucleocytoplasmorische transport van Rev-gebonden HIV mRNAs^22</su…

Materials

Acetic acid	Fisher Chemical	A38S-212
Acetonitrile	Fisher Chemical	A955-500
Acrylamide:Bisacrylamide	BioRad	1610158
Ammonium bicarbonate	Fisher Chemical	A643-500
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	7727-54-0
ANTI-Flag M2 affinity gel	Sigma-Aldrich	A2220
anti-Flag M2 mouse monoclonal IgG	Sigma-Aldrich	F3165
BioMax MS film	Carestream	8294985
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, 450 mL	Bio-Rad	5000006
B23 mouse monoclonal IgG	Santa Cruz Biotechnologies	sc-47725
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126
Carnation non-fat powdered milk	Nestle	N/A
Cell scraper	ThermoFisher Scientific	179693PK
C18IonKey nanoTile column	Waters	186003763
Corning 100-mm TC-treated culture dishes	Fisher Scientific	08-772-22
Dithiothreitol	Thermo Scientific	J1539714
1 x DPBS	Corning	21-030-CVRS
ECL Estern blotting substrate	Pierce	32106
Ethanol, 200 proof	Fisher Chemical	A409-4
FBS	Gibco	16000044
Formic Acid	Fisher Chemical	A117-50
GelCode blue stain reagent	ThermoFisher	24590
Glycerol	Fisher Chemical	56-81-5
goat-anti-mouse IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnologies	sc-2005
Iodoacetamide	ACROS Organics	122270050
KimWipe delicate task wiper	Kimberly Clark Professional	34120
L-glutamine	Gibco	25030081
Methanol	Fisher Chemical	67-56-1
NanoAcuity UPLC	Waters	N/A
Pierce Silver Stain Kit	Thermo Scientific	24600df
15-mL Polypropylene conical tube	Falcon	352097
Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa	Thermo Scientific	26616
Protease inhibitor cocktail	Roche	4693132001
Purified BSA	New England Biolabs	B9001
PVDF  Western blotting membrane	Roche	3010040001
Sodium Pyruvate	Gibco	11360070
10 x TBS	Fisher Bioreagents	BP2471500
TEMED	BioRad	1610880edu
Triton X-100 detergent solution	BioRad	1610407
Trizaic source	Waters	N/A
trypsin-EDTA	Corning	25-051-CIS
Tween 20	BioRad	1706531
Synapt G2 mass spectrometer	Waters	N/A
Whatman filter paper	Tisch Scientific	10427813