Un modello 3D in vitro e una pipeline computazionale per quantificare il potenziale vasculogenico dei progenitori endoteliali derivati da iPSC
Summary
I progenitori endoteliali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC-EP) hanno il potenziale di rivoluzionare i trattamenti delle malattie cardiovascolari e di consentire la creazione di modelli di malattie cardiovascolari più fedeli. Qui, vengono descritti l’incapsulamento di iPS-EP in microambienti tridimensionali di collagene (3D) e un’analisi quantitativa del potenziale vasculogenico di queste cellule.
Abstract
Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono una fonte di cellule proliferanti specifica per il paziente che può differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula somatica. I progenitori endoteliali bipotenti (EP), che possono differenziarsi nei tipi di cellule necessari per assemblare la vascolatura matura e funzionale, sono stati derivati sia da cellule staminali pluripotenti embrionali che indotte. Tuttavia, queste cellule non sono state valutate rigorosamente in ambienti tridimensionali e una misura quantitativa del loro potenziale vasculogenico rimane sfuggente. Qui, la generazione e l’isolamento di iPS-EP tramite lo smistamento cellulare attivato a fluorescente sono prima delineati, seguita da una descrizione dell’incapsulamento e della coltura di iPSC-EP in idrogel di collagene. Questo microambiente di imitazione della matrice extracellulare (ECM) incoraggia una robusta risposta vasculogenica; reti vascolari si formano dopo una settimana di cultura. La creazione di una pipeline computazionale che utilizza software open source per quantificare questa risposta vasculogenica è delineata. Questa pipeline è specificamente progettata per preservare l’architettura 3D del plesso capillare per identificare in modo affidabile il numero di rami, punti di diramazione e la lunghezza totale della rete con un input minimo da parte dell’utente.
Introduction
Cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) e altri tipi di cellule endoteliali primarie sono stati utilizzati per due decenni per modellare la germogliazione e lo sviluppo dei vasi sanguigni in vitro1. Tali piattaforme vascolari promettono di illuminare i meccanismi molecolari e tissutali delle malattie cardiovascolari e possono presentare informazioni fisiologiche sullo sviluppo di reti vascolari primitive2,3. Anche se il campo della modellazione vascolare ha assistito a progressi significativi, un saggio “standard d’oro” in grado di modellare quantitativamente e valutare lo sviluppo vascolare fisiologico rimane elusivo. La maggior parte dei protocolli pubblicati non riassumono adeguatamente la nicchia vascolare per incoraggiare la formazione di vasi sanguigni maturi e funzionali o non dispongono di un metodo per confrontare quantitativamente il potenziale vasculogenico dei tipi di cellule valutate in tre dimensioni ( 3D).
Molti modelli vascolari attuali sono limitati nella loro capacità di imitare la nicchia vascolare fisiologica. Una delle piattaforme in vitro più comunemente impiegate è il saggio di formazione del tubo a base di miscela proteica gelatinosa. In breve, gli HUVEC sono semidati come singole cellule su un sottile strato di gel che consiste di proteine raccolte da murini sarcoma matrice extracellulare (ECM); entro uno o due giorni, gli HUVEC si auto-assemblano in tubi primitivi4. Tuttavia, questo processo si verifica in due dimensioni (2D) e le cellule endoteliali (EC) utilizzate in questo saggio non formano lumen vuoti chiusi, limitando così il significato fisiologico di questi studi. Più recentemente, eCs e cellule di supporto (ad esempio, cellule staminali mesenchymal (MSC) e periciti) sono stati co-coltivati in microambienti 3D che simulano l’architettura fibrosa dell’ECM nativo, come collagene o idrogel5. Per modellare lo sviluppo vascolare in questo microambiente, le perline polimeriche rivestite con EC sono in genere impiegate6. L’aggiunta di fattori di crescita esogeni e/o di fattori di crescita secreti da altre cellule interstizialmente incorporate nell’idrogel può indurre le EC, ricoprendo le perline polimeriche, a germogliare e formare singoli lumen; il numero e il diametro dei germogli e dei vasi possono quindi essere calcolati. Tuttavia, questi germogli sono singolari e non formano una rete chiusa e connessa come si vede in condizioni fisiologiche e quindi ricorda più un modello di vascolatura tumorale. Sono stati utilizzati anche dispositivi microfluidici per imitare la nicchia vascolare e promuovere la formazione di vascolatura negli idrogel carico CE7,8. Tipicamente, un fattore di crescita angiogenico-gradiente viene applicato al mezzo di coltura cellulare circolante per indurre la migrazione e la germogliazione della CE. Le EC che costituiscono il lume dei vasi sviluppati sono sensibili allo stress di taglio indotto dall’applicazione del flusso di liquidi attraverso il dispositivo microfluidico; pertanto, questi dispositivi microfluidici catturano parametri fisiologici chiave che non sono accessibili nei modelli statici. Tuttavia, questi dispositivi richiedono costose capacità di microfabbricazione.
Ancora più importante, tutti e tre i modelli vascolari (2D, 3D, microfluidici) utilizzano in modo schiacciante le EC primarie e i tipi di cellule di supporto primari. Le cellule primarie non possono essere sviluppate in un’efficace terapia cardiovascolare perché le cellule darebbero una risposta immunitaria al momento dell’impianto; inoltre, gli HUVEC e tipi di cellule primarie simili non sono specifici del paziente e non catturano anomalie vascolari che si verificano in pazienti con una disposizione genetica o condizioni di salute preesistenti, ad esempio il diabete mellito. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) sono emerse nell’ultimo decennio come una fonte cellulare proliferale specifica del paziente che può essere differenziata in tutte le cellule somatiche nel corpo umano9. In particolare, sono stati pubblicati protocolli che delineano la generazione e l’isolamento di progenitori endoteliali derivati da iPSC (iPS-EP)10,11; Gli iPS-EP sono bipopotenti e possono, quindi, essere ulteriormente differenziati in cellule endoteliali e cellule muscolari lisce/periciti, i mattoni della vascolatura matura e funzionale. Solo uno studio ha dettagliato in modo convincente lo sviluppo di un plesso capillare primario da iPS-EP in un microambiente 3D12; sebbene questo studio sia fondamentale per comprendere l’assemblaggio iPSC-EP e differenziare gli idrogel naturali e sintetici, non ha confrontato quantitativamente le topologie di rete della vascolatura risultante. Un altro studio recente ha utilizzato il modello di perline polimerico per confrontare la germogliazione di HUVEC e ECs5derivati da iPSC . Pertanto, vi è una chiara necessità di chiarire ulteriormente i meccanismi di segnalazione fisica e chimica che regolano la vasculogenesi iPSC-EP nei microambienti 3D e di determinare se queste cellule sono adatte per la terapia ischemica e le malattie cardiovascolari Modellazione.
Nell’ultimo decennio, sono state sviluppate diverse pipeline computazionali e algoritmi di scheletrazione open source per quantificare e confrontare la lunghezza e la connettività della rete vascolare. Ad esempio, Charwat et al. ha sviluppato una pipeline basata su Photoshop per estrarre un’immagine filtrata e binaria di reti vascolari derivate da una co-cultura di cellule staminali derivate da adipose e superano gli EC in una matrice di fibrina13,14. Forse lo strumento di confronto delle topologie più utilizzato è AngioTool, un programma pubblicato online dal National Cancer Institute15; nonostante l’adozione diffusa del programma e la fedeltà ben documentata, il programma si limita ad analizzare le strutture simili a navi in due dimensioni e altri programmi, tra cui AngioSys e Wimasis, condividono la stessa limitazione dimensionale16. Potenti suite software come Imaris, Lucis e Metamorph sono state sviluppate per analizzare la topologia di rete della microvascolatura ingegnerizzata; tuttavia, queste suite sono proibitive dal costo per la maggior parte dei laboratori accademici e limitano l’accesso al codice sorgente, il che può ostacolare la capacità dell’utente finale di personalizzare l’algoritmo in base all’applicazione specifica. 3D Slicer, un pacchetto di imaging a risonanza magnetica/tomografia computerizzata open source, contiene un Toolkit di modellazione vascolare in grado di analizzare efficacemente la topologia delle reti vascolari 3D17; tuttavia, l’analisi dipende dal posizionamento manuale dei punti finali della rete da parte dell’utente, che possono diventare noiosi quando si analizza un set di dati di grandi dimensioni e può essere influenzato dalle distorsioni subconsce dell’utente. In questo manoscritto, una pipeline computazionale in grado di quantificare le reti vascolari 3D è descritta in dettaglio. Per superare le limitazioni sopra delineate, questa pipeline computazionale open source utilizza ImageJ per pre-elaborare le immagini confocali acquisite per caricare il volume 3D in un analizzatore di scheletri. L’analizzatore di scheletri utilizza un algoritmo di assottigliamento dell’asse mediale parallelo, ed è stato originariamente sviluppato da Kerschnitzki et al. per analizzare la lunghezza e la connettività delle reti di osteociti18; questo algoritmo può essere applicato in modo efficace per caratterizzare la lunghezza e la connettività della microvascolatura ingegnerizzata.
Complessivamente, questo protocollo delinea la creazione di reti microvascolari in microambienti 3D e fornisce una pipeline computazionale libera open source e user-bias per confrontare facilmente il potenziale vasculogenico degli iPS-EP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo prevede la coltura a lungo termine delle cellule in tre tipi di mezzi di coltura cellulare: E8, Basal LaSR ed EGM-2. Pertanto, si dovrebbe fare molta attenzione a sterilizzare in modo appropriato tutti i materiali. Inoltre, i camici da laboratorio e i guanti puliti con etanolo devono essere sempre indossati quando si lavora nella cappa di flusso laminare del laboratorio. Si raccomanda di testare frequentemente la contaminazione da micoplasma; se si osserva una grande quantità di detriti durante la colt…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dall’American Heart Association (numero di sovvenzione 15SDG25740035, assegnato a J.e.), dal National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) del National Institutes of Health (numero di sovvenzione EB007507, assegnato a C.C.) e l’Alleanza per la ricerca e la formazione rigenerativa di riabilitazione (AR3T, sovvenzione 1 P2C HD086843-01, assegnato a J. Vorremmo riconoscere la prof.ssa Jeanne Stachowiak (L’Università del Texas ad Austin) per i suoi consigli tecnici sulla microscopia confocale. Siamo anche grati per le discussioni con Samuel Mihelic (L’Università del Texas ad Austin), la Dott.ssa Alicia Allen (L’Università del Texas ad Austin), la dott.ssa Julie Rytlewski (Adaptive Biotech) e la dott.ssa Leon Bellan (Vanderbilt University) per la loro l’analisi computazionale delle reti 3D. Infine, ringraziamo il Dr. Xiaoping Bao (Università della California, Berkeley) per i suoi consigli sulla differenziazione degli iPSC in iPSC-EP.
Materials
| µ-Slide Angiogenesis | Ibidi | N/A | A flat, glass bottom tissue-culture plate with side walls enables facile confocal imaging |
| 96 well, round bottom, ultra low attachment microplate, sterile | Corning | 7007 | Prevents the binding of cell-laden collagen hydrogels to the cell culture dish |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7920 | Gentle cell detachment solution; does not degrade extracellular epitopes vital for FACS |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Scientific | 12634010 | The base media for iPSC-EP differentiation. |
| Barnstead GenPure xCAD Plus | Thermo Fisher Scientific | 50136165 | Water purification system; others can be readily substituted |
| Bovine Serum Albumin solution,7.5% in DPBS, sterile-filtered, BioXtra, suitable for cell culture | Fisher Scientific | A8412 | To preserve cell viability when FACs sorting |
| CD34-PE, human (clone: AC136) | Miltenyi Biotec | 130-098-140 | Antibody used for FACs isolation of iPSC-EPs |
| CHIR99021 | LC Laboratories | C-6556 | Induces the formation of mesoderm from pluripotent stem cells |
| Collagen I Rat Tail High Protein 100 mg | VWR | 354249 | Main component of the 3D microenvironment |
| Conical centrifuge tubes (15/50 mL) | Fisher Scientific | 14-959-49D/A | Used to store and mix relatively large volumes of reagents and cell culture media |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | To counterstain and visualize cell nuclei |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320-082 | For dilution of Matrigel and thawing of pluripotent stem cells |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-250 | To wash monolayer cultures |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E8008 | For passaging of pluripotent stem cell colonies and to prevent cell aggregation when FACs sorting |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | PromoCell | C-22011 | Promotes endothelial cell viability and proliferation |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For maintenance of pluripotent stem cells |
| Glycine,BioUltra, for molecular biology, >=99.0% (NT) | Sigma-Aldrich | 50046 | Neutralizes remaining detergent |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate,>=95% | Sigma-Aldrich | A8960 | Component of iPSC-EP differentiation medium |
| MATLAB | MathWorks | 1.8.0_152 | Multi-paradigm numerical computing environment (free available at most academic institutions) |
| Matrigel Matrix GFR PhenolRF Mouse 10 mL (gelatinous protein mixture) | Fisher Scientific | 356231 | Diluted in DMEM/F12 to coat plates for iPSC-EP differentiation |
| Medium-199 10X | Thermo Fisher Scientific | 1825015 | Used to balance final hydrogel osmolarity and pH |
| Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | VWR | 87003-294 | Stores small volumes of reagents |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | The main ingredient of the immunostaining solutions |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Antibiotic used after sorting to remove possible contamination from FACS instrument |
| Recombinant Human VEGF 165 Protein | R&D Systems | 293-VE | Mitogen that stimulates endothelial cell proliferation and tubulogenesis |
| Rhodamine phalloidin | Themo Fisher Scientific | R415 | To identify F-actin deposition and therfore outline the borders of the vascular networks |
| Triton X-100 (nonionic surfactant) | Sigma-Aldrich | X-100 | Detergent used to gently permeabilize cells |
| Tween-20 (emulsifying reagent) | Fisher Scientific | BP337 | Increases the binding specificity of the added antibodies |
| VE-Cadherin (F-8) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9989 | To identify 3D endothelial lumen in collagen hydrogels |
| Vitronectin | ThermoFisher | A14700 | For maintenance of pluripotent stem cells |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Preserves pluripotent stem cell and iPSC-EP viability when dissociated and re-seeded |
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