عزل وتلطيخ الخلايا الكيراتينية الجلد الماوس لدورة الخلية تحليل محدد للتعبير البروتين الخلوي عن طريق قياس الخلايا الشامل
Summary
يصف هذا البروتوكول كيفية عزل خلايا القرنية الجلدية من نماذج الماوس، ووصمة عار مع الأجسام المضادة ذات العلامات المعدنية، وتحليل الخلايا الملونة عن طريق قياس الخلايا الشاملة من أجل تحديد نمط التعبير من البروتينات ذات الأهمية في مراحل دورة الخلية المختلفة.
Abstract
الهدف من هذا البروتوكول هو الكشف عن وقياس التغيرات في التعبير البروتين بطريقة تعتمد على دورة الخلية باستخدام خلايا واحدة معزولة عن البشرة من جلد الماوس. هناك سبع خطوات هامة: فصل البشرة عن الأدمة، وهضم البشرة، وتلطيخ مجموعات الخلايا الجلدية مع سيسبلاتين، والترميز عينة، وتلطيخ مع الأجسام المضادة المعدنية الموسومة لعلامات دورة الخلية والبروتينات من الفائدة، والكشف عن الأجسام المضادة ذات العلامات المعدنية عن طريق قياس الخلايا الشامل، وتحليل التعبير في مختلف مراحل دورة الخلية. ميزة هذا النهج على الأساليب النسيجية هي إمكانية تحليل نمط التعبير من > 40 علامات مختلفة في خلية واحدة في مراحل مختلفة من دورة الخلية. كما يسمح هذا النهج لتحليل الارتباط متعدد المتغيرات للتعبير البروتيني الذي هو أكثر قابلية للقياس الكمي من أساليب النسيج/التصوير. العيب في هذا البروتوكول هو أن هناك حاجة إلى تعليق الخلايا المفردة، مما يؤدي إلى فقدان معلومات الموقع التي يوفرها تلطيخ أقسام الأنسجة. وقد يتطلب هذا النهج أيضاً إدراج علامات إضافية لتحديد أنواع الخلايا المختلفة في حالات تعليق الخلايا الخام. تطبيق هذا البروتوكول واضح في تحليل نماذج أمراض الجلد فرط البلاستيك. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول لتحليل نوع فرعي محدد من الخلايا (مثل الخلايا الجذعية) بإضافة أجسام مضادة خاصة بالنسب. ويمكن أيضا تكييف هذا البروتوكول لتحليل خلايا الجلد في الأنواع التجريبية الأخرى.
Introduction
لا يزال ارتباط التعبير الجيني بمراحل دورة الخلايا يشكل تحدياً في تحليل النماذج الحيوانية لأمراض فرط التنسج مثل السرطان. ويتمثل جزء من هذا التحدي في الكشف المشترك عن البروتينات ذات الأهمية مع علامات الانتشار. يمكن العثور على الخلايا التكاثرية في مراحل دورة الخلايا المختلفة بما في ذلك G1، S، G2، وM. Ki67 هي واحدة من علامات الانتشار الأكثر استخداما ويتم التعبير عنها في جميع مراحل دورة الخلية. وقد استخدمت على نطاق واسع في تحليل كلمن الإنسان والأنسجة الماوس 1،2،3. ومع ذلك، مثل غيرها من علامات الانتشار العامة، Ki67 لا يميز مراحل دورة الخلية الفردية. نهج أكثر دقة يستخدم دمج النظائر النيوكليوتيد الثيميدين مثل بروموديوكسيوريبين (BrdU) في الخلايا التي تكرر بنشاط الجينوم (أي المرحلة S)4،5. عيب واحد لاستخدام النظائر النيوكليوتيد هو الحاجة إلى إدارتها للعيش الحيوانات قبل ساعات من التحليل. يتم الكشف عن Ki67 وBrdU عادة على أقسام الأنسجة الثابتة عن طريق استخدام الأجسام المضادة. وتتمثل إحدى مزايا هذا النهج في أنه يمكن التأكد من موقع POIs داخل بنية الأنسجة (على سبيل المثال، الطبقة القاعدية من البشرة الجلدية). ولا يتطلب هذا النهج أيضاً تفكك الأنسجة الذي قد يؤدي إلى تغييرات في التعبير الجيني. أحد العيوب هو أن تثبيت الأنسجة أو معالجة الأنسجة لOCT المجمدة أو تقسيم البارافين قد occlude أهداف الأجسام المضادة (أي، مستضدات). استرجاع المستضدات يتطلب عادة الحرارة أو هضم الأنسجة. كما يمكن أن يكون تحديد حجم التلطيخ أمراً صعباً. ويرجع ذلك إلى الاختلافات في تلطيخ، سمك القسم، وكشف إشارة، والتحيز المجرب. وعلاوة على ذلك، يمكن الكشف عن عدد محدود من العلامات في وقت واحد في معظم التجهيزات المختبرية النموذجية. ومع ذلك، فإن نُهُج تلطيخ المضاعفات الأحدث تعد بالتغلب على هذه القيود؛ أمثلة هي التصوير قياس السيتومترية الجماعية وتضخيم إشارة التيراميد6،7.
قياس التدفق هو آخر التكنولوجيا القوية للكشف عن الخلايا المنتشرة. فإنه يسمح للكشف عن متعددة من علامات في نفس الخلايا ولكن يتطلب تفكك الأنسجة لمعظم أنواع الخلايا غير المكونة للدم. يتم تحليل الخلايا المتكاثرة بشكل روتيني باستخدام الأصباغ التي تربط الحمض النووي (على سبيل المثال، بروبيوديوم يوديد (PI))8. تدفق cytometry يسمح أيضا تحديد أكثر دقة من مراحل دورة الخلية عندما يقترن الكشف عن إدراج BrdU9. على الرغم من اتباع نهج قوي، BrdU / PI تدفق قياس السيتومترية لديها عيوبها. وهي غير قادرة على حل مرحلتي G2/M وG0/G1 دون إدراج أجسام مضادة خاصة بالمرحلة. ومع ذلك، فإن عدد الأجسام المضادة التي يمكن استخدامها محدود بالفلورة الخلوية، والانتشار الطيفي لانبعاثات الفلوروفور، واستخدام ضوابط التعويض. هذا القيد علامات عليه أكثر تحديا وشاقة للكشف عن التعبير عن علامات دورة الخلية مع POIs. وهناك نهج أكثر سهولة هو استخدام قياس السيتومتري ة الشامل10،11. وتستخدم هذه التكنولوجيا الأجسام المضادة المترافقة المعدنية التي لها طيف كشف أضيق. مرة واحدة يتم تلوين الخلايا مع الأجسام المضادة ذات العلامات المعدنية، يتم تبخرها، والمعادن التي تم الكشف عنها عن طريق قياس الطيف الكتلي وقت الطيران (CyTOF). نظرًا لهذه الخصائص، يتيح قياس السيتومتري ة الكتلة الكشف المتعدد المضاعفات عن >40 علامة مختلفة باستخدام الأنظمة الأساسية الموجودة10و11 . وبالإضافة إلى ذلك، فمن الممكن لعينات الباركود مع المعادن التي تؤدي إلى وفورات الأجسام المضادة الثمينة مع الحد من العينة إلى عينة تلطيخ تقلب. من ناحية أخرى، قياس السيتومتري ة الكتلة لديه العديد من العيوب. هناك عدد محدود من الأجسام المضادة الموسومة بالمعادن المتاحة تجاريا للخلايا المشتقة من الدم غير الدم. القياس الكمي لمحتوى الحمض النووي أقل حساسية مقارنة باستخدام أصباغ الحمض النووي الفلورية والقياس الخلوي الشامل لديه مجموعة ديناميكية منخفضة من الكشف عن إشارة بالمقارنة مع قياس تدفق الفلورة.
تم تصميم البروتوكول الموضح هنا لتحليل ديناميات دورة الخلية من الخلايا الكيراتينية المعزولة حديثا (KCs) من جلد الماوس وتميز خلية دورة تعبير البروتين محددة في هذه الخلايا باستخدام قياس الخلايا الشامل. يمكن استخدام هذا البروتوكول أيضًا مع الخلايا المستزرعة أو تكييفه مع أنواع الخلايا الأخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن إكمال البروتوكول الموضح في هذه الورقة في حوالي 8 ح. والنتيجة النهائية هي تعليق الخلايا المخصب في KCs التي يمكن تحليلها للتعبير عن البروتين بطريقة تعتمد على دورة الخلية. وقد حددت العديد من الدراسات السابقة طرق لعزل KCs من الجلد البشري والماوس16،25. وتشمل هذه …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وجاء الدعم لهذا العمل من قسم الأمراض الجلدية، ومركز غيتس للطب التجديدي في جامعة كولورادو وجامعة كولورادو (UC) مركز الأمراض الجلدية مورفولوجيا والنوى الفينوتين (NIAMS P30 AR057212). يقر المؤلفون بـ “مركز السرطان في جامعة كاليفورنيا” “الموارد المشتركة للسيتوميتري” ومنحة الدعم (NCI P30 CA046934) لتشغيل مقياس الخلايا الكتلي، وهم ممتنون لكارين هيلم وكريستين تشايلدز في صميم نصائحهم الخبيرة بشأن التدفق ومقياس الخلايا الشامل تقنيات.
Materials
| 12-well plate | Cell Treat | 229512 | |
| Intercalator solution | Fluidigm | 201192A | 125 µM – Ir intercalator solution |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | 16 % PFA |
| Strainer cap flow tubes | Fisher/Corning | 352235 | 35 µm pore size |
| Cell sieve | Fisher | 22363547 | 40 μm pore size |
| Cell detatchment solution | CELLnTEC | CnT-ACCUTASE-100 | Accutase |
| Iodine Solution | ThermoFisher/Purdue | 67618-151-17 | Betadine 7.5%-iodine surgical scrub |
| Barcode permeabilization buffer | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| Barcodes | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| pH strips | EMD | 9590 | colorpHast |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Dulbecco’s Modified Eagle Media |
| Fine forceps | Dumont & Fils | 0109-5-PO | Dumostar #5 |
| Curved precision forceps | Dumont & Fils | 0109-7-PO | Dumostar #7 |
| Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | EQ Four Element Calibration Beads |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | Hank's Balanced Salt Solution |
| Water | Fisher | SH30538.03 | Hyclone Molecular Biology grade water |
| Iododeoxyuridine | Sigma | I7125 | IdU |
| Cryo vials | ThermoFisher | 366656PK | internal thread |
| Cell Staining buffer | Fluidigm | 201068 | Maxpar Cell Staining buffer |
| Fix & Perm buffer | Fluidigm | 201067 | Maxpar Fix & Perm buffer |
| Fix I buffer | Fluidigm | 201065 | Maxpar Fix I buffer |
| Phosphate buffered saline | Rockland | MB-008 | Metal free 10x PBS |
| isopropanol-freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | Mr.Frosty |
| Sodium hydroxide | Fisher | BP359-500 | NaOH |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2900 | Supplied by Genesee 32-107 |
| 15 mL conical | Olympus/Genesee | 28-101 | |
| 50 mL conical | Olympus/Genesee | 28-106 | |
| 6-well plate | Cell Treat | 229506 | |
| Cisplatin | Sigma | 479306 | |
| Dispase II | Sigma/Roche | 4942078001 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hydrochloric acid | Fisher | A144-212 | |
| Nuclear Antigen Staining permeabilization buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Nuclear Antigen Staining buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309626 | |
| Type IV Collagenase | Worthington Bioscience | CLSS-4 |
Referências
- Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer. Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).
- Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma. BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).
- Ryan, W. K. Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase. Cell Death & Differentiation. , (2018).
- Magaud, J. P. Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors. Science. 174 (4010), 714-717 (1971).
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
- Bandura, D. R. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).
- Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
- Brodie, T. M., Tosevski, V. High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry. Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
- Zhang, L. Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis. PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).
- Zunder, E. R. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
- Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining. Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).
- Finck, R. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development. Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).
- Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice. Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).
- Liu, Z. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).
- Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
- Germain, L. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Fluhr, J. W. Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption. British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).
- Webb, A., Li, A., Kaur, P. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin. Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).
- Torchia, E. C., et al. A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors. Pesquisa do Câncer. 69 (18), 7207-7215 (2009).
- Frei, A. P. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).
