Isolatie en kleuring van de muis huid keratinocyten voor celcyclus specifieke analyse van cellulaire eiwit expressie door massa Cytometrie
Summary
Dit protocol beschrijft hoe de huid keratinocyten van Muismodellen te isoleren, te vlekken met metaal-gelabelde antilichamen, en om bevlekte cellen te analyseren door massa cytometrie om het patroon van de expressie van eiwitten van belang in de verschillende celcyclus fasen profiel.
Abstract
Het doel van dit protocol is om te detecteren en te kwantificeren eiwit expressie veranderingen in een cel cyclus-afhankelijke manier met behulp van enkelvoudige cellen geïsoleerd uit de epidermis van de muis huid. Er zijn zeven belangrijke stappen: scheiding van de epidermis van de dermis, vertering van de epidermis, kleuring van de epidermale celpopulaties met cisplatine, monster barcodering, kleuring met metalen gelabelde antilichamen voor celcyclus markers en eiwitten van belang, detectie van met metaal gelabelde antilichamen door massa cytometrie en de analyse van de expressie in de verschillende fasen van de celcyclus. Het voordeel van deze benadering over histologische methoden is het potentieel om het expressie patroon van > 40 verschillende markers in een enkele cel in verschillende fasen van de celcyclus te testen. Deze aanpak maakt het ook mogelijk voor de multivariate correlatieanalyse van eiwit expressie die meer kwantificeerbaar is dan histologische/beeldvormingsmethoden. Het nadeel van dit protocol is dat een schorsing van afzonderlijke cellen nodig is, wat resulteert in het verlies van locatie-informatie die wordt verstrekt door de kleuring van weefsel secties. Deze aanpak kan ook vereisen dat extra markeringen worden opgenomen om verschillende celtypen in de suspensies van ruwe cellen te identificeren. De toepassing van dit protocol is duidelijk in de analyse van hyperplastische huidziekte modellen. Bovendien kan dit protocol worden aangepast voor de analyse van specifieke subtypen van cellen (bv. stamcellen) door toevoeging van Lineage-specifieke antilichamen. Dit protocol kan ook worden aangepast voor de analyse van huidcellen in andere experimentele soorten.
Introduction
Correlatie van genexpressie met celcyclus fasen blijft een uitdaging in de analyse van diermodellen van hyperkunststof ziekten zoals kanker. Een deel van deze uitdaging is de co-detectie van eiwitten van belang (POI) met markers van proliferatie. Proliferatieve cellen kunnen worden gevonden in verschillende fasen van de cyclus van de cel, met inbegrip van G1, S, G2, en M. Ki67 is een van de meest gebruikte markers van proliferatie en wordt uitgedrukt in alle fasen van de celcyclus. Het is uitgebreid gebruikt in de analyse van zowel menselijke als muis weefsels1,2,3. Echter, net als andere algemene proliferatie markers, Ki67 niet onderscheiden individuele celcyclus fasen. Een preciezere aanpak maakt gebruik van de opname van thymidine nucleotide-analogen zoals bromodeoxyuridine (Brdu) in cellen die hun genoom actief repliceren (d.w.z. S-fase)4,5. Een nadeel van het gebruik van nucleotide-analogen is de noodzaak om ze te beheren tot levende dieren uren vóór de analyse. Ki67 en BrdU worden vaak aangetroffen op vaste weefsel gedeelten door het gebruik van antilichamen. Een voordeel van deze aanpak is dat de locatie van Poi’s kan worden vastgesteld binnen de weefsel architectuur (bijv. de basale laag huid epidermis). Deze aanpak vereist ook geen weefsel dissociatie die kan leiden tot veranderingen in genexpressie. Een nadeel is dat de weefsel fixatie of de verwerking van het weefsel voor LGO bevroren of paraffine snijden de doelen van antilichamen kan occlude (d.w.z. antigenen). Het ophalen van antigenen meestal vereist warmte of weefsel spijsvertering. Kwantificering van kleurings intensiteiten kan ook een uitdaging zijn. Dit is te wijten aan variaties in kleuring, sectie dikte, signaaldetectie en experimenterbias. Bovendien kan een beperkt aantal markers tegelijkertijd worden gedetecteerd in de meeste typische laboratorium opstellingen. Toch, nieuwere multiplex kleuring benaderingen beloven om deze beperkingen te overwinnen; voorbeelden zijn beeldvormings massa cytometrie en tyramide signaalversterking6,7.
Flow flowcytometrieonderzoeken is een andere krachtige technologie om prolifererende cellen op te sporen. Het zorgt voor multiplex detectie van markers in dezelfde cellen, maar vereist weefsel dissociatie voor de meeste niet-hematopoietische celtypen. De analyse van prolifererende cellen wordt routinematig gedaan door het gebruik van kleurstoffen die DNA binden (bijv. Propidium jodide (PI))8. Flow cytometrie maakt ook een nauwkeuriger bepaling van de fasen van de celcyclus mogelijk in combinatie met de detectie van BrdU-opname9. Hoewel een krachtige aanpak, Brdu/Pi flow flowcytometrieonderzoeken heeft zijn nadelen. Het is niet in staat om de G2/M-en G0/G1-fasen op te lossen zonder de toevoeging van fasespecifieke antilichamen. Het aantal antilichamen dat kan worden gebruikt, wordt echter beperkt door cellulaire auto fluorescentie, spectrale overloop van de-emissies en het gebruik van compensatie controles. Deze beperking markt het uitdagender en bewerkelijk om de uitdrukking van celcyclus markeringen met Poi’s te co-detecteren. Een meer facile aanpak is het gebruik van massa flowcytometrieonderzoeken10,11. Deze technologie maakt gebruik van metaal geconjugeerde antilichamen die een smaller detectie spectrum hebben. Zodra cellen zijn gekleurd met metaal-gelabelde antilichamen, ze zijn verdampt, en de metalen gedetecteerd door cytometrie tijd-van-vlucht (CyTOF) massaspectrometrie. Door deze eigenschappen, massa cytometrie maakt de multiplex detectie van > 40 verschillende markers met behulp van bestaande platformen10,11. Daarnaast is het mogelijk om stalen streepjescodes met metalen die resulteren in de besparingen van kostbare antilichamen, terwijl het verminderen van monster-naar-monster kleuring variabiliteit. Aan de andere kant, massa cytometrie heeft verschillende nadelen. Er zijn een beperkt aantal commercieel verkrijgbare antilichamen met metaal-Tags voor niet-bloed afgeleide cellen. Kwantificering van DNA-inhoud is minder gevoelig in vergelijking met het gebruik van fluorescerende DNA-kleurstoffen en massa cytometrie heeft een verminderd dynamisch bereik van signaaldetectie in vergelijking met fluorescentie flow cytometrie.
Het protocol dat hier wordt beschreven, is ontworpen om de dynamiek van de celcyclus van nieuw geïsoleerde keratinocyten (KCs) van de muis skin te analyseren en celcyclus specifieke eiwit expressie in deze cellen te karakteriseren met behulp van massa cytometrie. Dit protocol kan ook worden gebruikt met gekweekte cellen of aangepast aan andere celtypen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het in dit document beschreven protocol kan in ongeveer 8 uur worden ingevuld. Het eindresultaat is een suspensie van cellen verrijkt in KCs die kunnen worden geanalyseerd voor eiwit expressie in een celcyclus-afhankelijke manier. Verschillende eerdere studies hebben methoden beschreven om KCS te isoleren van de menselijke en muis huid16,25. Deze studies omvatten ook protocollen voor de isolatie van KCS voor flow flowcytometrieonderzoeken26</sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ondersteuning voor dit werk kwam van het departement Dermatologie, het Gates Center for regeneratieve geneeskunde aan de Universiteit van Colorado en de Universiteit van Colorado (UC) huidziekte centrum morfologie en Fenotyping cores (NIAMS P30 AR057212). De auteurs erkennen de UC Cancer Center flow Cytometrie Shared resource en ondersteuning Grant (NCI P30 CA046934) voor de werking van de Mass cytometer en zijn dankbaar voor Karen helm en Christine Childs in de kern voor hun deskundig advies over flow en Mass flowcytometrische Technieken.
Materials
| 12-well plate | Cell Treat | 229512 | |
| Intercalator solution | Fluidigm | 201192A | 125 µM – Ir intercalator solution |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | 16 % PFA |
| Strainer cap flow tubes | Fisher/Corning | 352235 | 35 µm pore size |
| Cell sieve | Fisher | 22363547 | 40 μm pore size |
| Cell detatchment solution | CELLnTEC | CnT-ACCUTASE-100 | Accutase |
| Iodine Solution | ThermoFisher/Purdue | 67618-151-17 | Betadine 7.5%-iodine surgical scrub |
| Barcode permeabilization buffer | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| Barcodes | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| pH strips | EMD | 9590 | colorpHast |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Dulbecco’s Modified Eagle Media |
| Fine forceps | Dumont & Fils | 0109-5-PO | Dumostar #5 |
| Curved precision forceps | Dumont & Fils | 0109-7-PO | Dumostar #7 |
| Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | EQ Four Element Calibration Beads |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | Hank's Balanced Salt Solution |
| Water | Fisher | SH30538.03 | Hyclone Molecular Biology grade water |
| Iododeoxyuridine | Sigma | I7125 | IdU |
| Cryo vials | ThermoFisher | 366656PK | internal thread |
| Cell Staining buffer | Fluidigm | 201068 | Maxpar Cell Staining buffer |
| Fix & Perm buffer | Fluidigm | 201067 | Maxpar Fix & Perm buffer |
| Fix I buffer | Fluidigm | 201065 | Maxpar Fix I buffer |
| Phosphate buffered saline | Rockland | MB-008 | Metal free 10x PBS |
| isopropanol-freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | Mr.Frosty |
| Sodium hydroxide | Fisher | BP359-500 | NaOH |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2900 | Supplied by Genesee 32-107 |
| 15 mL conical | Olympus/Genesee | 28-101 | |
| 50 mL conical | Olympus/Genesee | 28-106 | |
| 6-well plate | Cell Treat | 229506 | |
| Cisplatin | Sigma | 479306 | |
| Dispase II | Sigma/Roche | 4942078001 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hydrochloric acid | Fisher | A144-212 | |
| Nuclear Antigen Staining permeabilization buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Nuclear Antigen Staining buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309626 | |
| Type IV Collagenase | Worthington Bioscience | CLSS-4 |
Referências
- Guzinska-Ustymowicz, K., Pryczynicz, A., Kemona, A., Czyzewska, J. Correlation between proliferation markers: PCNA, Ki-67, MCM-2 and antiapoptotic protein Bcl-2 in colorectal cancer. Anticancer Research. 29 (8), 3049-3052 (2009).
- Ladstein, R. G., Bachmann, I. M., Straume, O., Akslen, L. A. Ki-67 expression is superior to mitotic count and novel proliferation markers PHH3, MCM4 and mitosin as a prognostic factor in thick cutaneous melanoma. BioMedCentral Cancer. 10, 140 (2010).
- Ryan, W. K. Activation of S6 signaling is associated with cell survival and multinucleation in hyperplastic skin after epidermal loss of AURORA-A Kinase. Cell Death & Differentiation. , (2018).
- Magaud, J. P. Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromodeoxyuridine. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 37 (10), 1517-1527 (1989).
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
- Toth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Kraemer, P. M., Petersen, D. F., Van Dilla, M. A. DNA constancy in heteroploidy and the stem line theory of tumors. Science. 174 (4010), 714-717 (1971).
- Dolbeare, F., Gratzner, H., Pallavicini, M. G., Gray, J. W. Flow cytometric measurement of total DNA content and incorporated bromodeoxyuridine. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 80 (18), 5573-5577 (1983).
- Bandura, D. R. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).
- Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 484-494 (2013).
- Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
- Brodie, T. M., Tosevski, V. High-Dimensional Single-Cell Analysis with Mass Cytometry. Current Protocols in Immunology. 118, 5.11.11-15.11.25 (2017).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visual Experimentation. 122, (2017).
- Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice. Nature Protocols. 3 (5), 799-810 (2008).
- Zhang, L. Defects in Stratum Corneum Desquamation Are the Predominant Effect of Impaired ABCA12 Function in a Novel Mouse Model of Harlequin Ichthyosis. PLoS One. 11 (8), e0161465 (2016).
- Zunder, E. R. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).
- Sumatoh, H. R., Teng, K. W., Cheng, Y., Newell, E. W. Optimization of mass cytometry sample cryopreservation after staining. Cytometry A. 91 (1), 48-61 (2017).
- Finck, R. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Trowbridge, I. S., Thomas, M. L. CD45: an emerging role as a protein tyrosine phosphatase required for lymphocyte activation and development. Annual Review of Immunology. 12, 85-116 (1994).
- Torchia, E. C., Boyd, K., Rehg, J. E., Qu, C., Baker, S. J. EWS/FLI-1 induces rapid onset of myeloid/erythroid leukemia in mice. Molecular and Cellular Biology. 27 (22), 7918-7934 (2007).
- Liu, Z. A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue. Journal of Visual Experimentation. (138), (2018).
- Jensen, K. B., Driskell, R. R., Watt, F. M. Assaying proliferation and differentiation capacity of stem cells using disaggregated adult mouse epidermis. Nature Protocols. 5 (5), 898-911 (2010).
- Germain, L. Improvement of human keratinocyte isolation and culture using thermolysin. Burns. 19 (2), 99-104 (1993).
- Fluhr, J. W. Impact of anatomical location on barrier recovery, surface pH and stratum corneum hydration after acute barrier disruption. British Journal of Dermatology. 146 (5), 770-776 (2002).
- Webb, A., Li, A., Kaur, P. Location and phenotype of human adult keratinocyte stem cells of the skin. Differentiation. 72 (8), 387-395 (2004).
- Torchia, E. C., et al. A genetic variant of Aurora kinase A promotes genomic instability leading to highly malignant skin tumors. Pesquisa do Câncer. 69 (18), 7207-7215 (2009).
- Frei, A. P. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nature Methods. 13 (3), 269-275 (2016).
