Isolierung und Färbung der Maushaut Keratinozyten für Zellzyklus spezifische Analyse der zellulären Proteinexpression durch Massenzytometrie
Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie Hautkeratinozyten von Mausmodellen isoliert werden, mit metallmarkierten Antikörpern gefärbt werden und wie man gefärbte Zellen durch Massenzytometrie analysiert, um das Expressionsmuster von Proteinen zu profilieren, die in den verschiedenen Zellzyklusphasen von Interesse sind.
Abstract
Ziel dieses Protokolls ist es, Proteinexpressionsänderungen auf zellzyklusabhängige Weise mithilfe einzelner Zellen zu erkennen und zu quantifizieren, die von der Epidermis der Maushaut isoliert sind. Es gibt sieben wichtige Schritte: Trennung der Epidermis von der Dermis, Verdauung der Epidermis, Färbung der epidermalen Zellpopulationen mit Cisplatin, Proben-Barcoding, Färbung mit metallmarkierten Antikörpern für Zellzyklusmarker und Proteine von Interesse, Detektion von metallmarkierten Antikörpern durch Massenzytometrie und die Analyse der Expression in den verschiedenen Zellzyklusphasen. Der Vorteil dieses Ansatzes gegenüber histologischen Methoden ist das Potenzial, das Expressionsmuster von >40 verschiedenen Markern in einer einzelnen Zelle in verschiedenen Phasen des Zellzyklus zu assayen. Dieser Ansatz ermöglicht auch die multivariate Korrelationsanalyse der Proteinexpression, die quantifizierbarer ist als histologische/bildgebende Verfahren. Der Nachteil dieses Protokolls ist, dass eine Suspension einzelner Zellen erforderlich ist, was zum Verlust von Standortinformationen führt, die durch die Färbung von Gewebeabschnitten bereitgestellt werden. Dieser Ansatz kann auch die Aufnahme zusätzlicher Marker erfordern, um verschiedene Zelltypen in Rohzellsuspensionen zu identifizieren. Die Anwendung dieses Protokolls zeigt sich in der Analyse von hyperplastischen Hautkrankheitsmodellen. Darüber hinaus kann dieses Protokoll für die Analyse bestimmter Untertypen von Zellen (z. B. Stammzellen) durch Zugabe von linienspezifischen Antikörpern angepasst werden. Dieses Protokoll kann auch für die Analyse von Hautzellen in anderen Versuchsarten angepasst werden.
Introduction
Die Korrelation der Genexpression mit den Zellzyklusstadien bleibt eine Herausforderung bei der Analyse von Tiermodellen hyperplastischer Krankheiten wie Krebs. Ein Teil dieser Herausforderung ist die Ko-Detektion von Proteinen von Interesse (POI) mit Markern der Proliferation. Proliferative Zellen können in verschiedenen Zellzyklusphasen einschließlich G1, S, G2 und M gefunden werden. Ki67 ist einer der am häufigsten verwendeten Marker der Proliferation und wird in allen Phasen des Zellzyklus exprimiert. Es wurde ausgiebig in der Analyse von menschlichen und Mausgewebe1,2,3verwendet. Jedoch, wie andere allgemeine Proliferation Marker, Ki67 erkennt nicht einzelne Zellzyklusphasen. Ein präziserer Ansatz nutzt die Einbeziehung von Thymidin-Nukleotid-Analogen wie Bromodeoxyuridin (BrdU) in Zellen, die ihr Genom aktiv replizieren (d.h. S-Phase)4,5. Ein Nachteil der Verwendung von Nukleotid-Analoga ist die Notwendigkeit, sie lebenden Tieren Stunden vor der Analyse zu verabreichen. Ki67 und BrdU werden häufig auf festen Gewebeabschnitten durch die Verwendung von Antikörpern nachgewiesen. Ein Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass die Position von POIs innerhalb der Gewebearchitektur (z. B. der Basalschicht der Hautepidermis) ermittelt werden kann. Dieser Ansatz erfordert auch keine Gewebedissoziation, die zu Veränderungen in der Genexpression führen kann. Ein Nachteil ist, dass die Gewebefixierung oder die Verarbeitung des Gewebes für OCT eingefroren oder Paraffin-Sektion kann Antikörper-Ziele (d. h. Antigene) okkludieren. Die Rückgewinnung von Antigenen erfordert in der Regel Wärme- oder Gewebeverdauung. Die Quantifizierung der Färbeintensitäten kann ebenfalls eine Herausforderung darstellen. Dies ist auf Variationen in Färbung, Schnittdicke, Signalerkennung und Experimentierverzerrung zurückzuführen. Darüber hinaus kann eine begrenzte Anzahl von Markern gleichzeitig in den meisten typischen Labor-Setups nachgewiesen werden. Doch neuere Multiplex-Färbungsansätze versprechen, diese Einschränkungen zu überwinden; Beispiele sind bildgebende Massenzytometrie und Tyramid-Signalverstärkung6,7.
Die Durchflusszytometrie ist eine weitere leistungsstarke Technologie zur Erkennung von sich ausbreitenden Zellen. Es ermöglicht die Multiplex-Erkennung von Markern in den gleichen Zellen, erfordert aber Gewebedissoziation für die meisten nicht-hämatopoetischen Zelltypen. Die Analyse von vermehrenden Zellen erfolgt routinemäßig durch die Verwendung von Farbstoffen, die DNA binden (z.B. Propidium Iodid (PI))8. Die Durchflusszytometrie ermöglicht auch eine genauere Bestimmung der Zellzyklusphasen in Verbindung mit dem Nachweis der BrdU-Inkorporation9. Obwohl ein leistungsstarker Ansatz, BrdU / PI Durchflusszytometrie hat seine Nachteile. Es ist nicht in der Lage, die G2/M- und G0/G1-Phasen ohne die Einbeziehung phasenspezifischer Antikörper zu lösen. Die Anzahl der Antikörper, die verwendet werden können, wird jedoch durch zelluläre Autofluoreszenz, spektrales Ausstrahlung von Fluorophoremissionen und die Verwendung von Kompensationskontrollen begrenzt. Diese Einschränkung markiert es schwieriger und mühsamer, die Expression von Zellzyklusmarkern mit POIs zu erkennen. Ein leichterer Ansatz ist die Verwendung von Massenzytometrie10,11. Diese Technologie verwendet metallkonjugierte Antikörper, die ein schmaleres Detektionsspektrum haben. Sobald Zellen mit metallgetaggten Antikörpern gefärbt sind, werden sie verdampft und die Metalle durch Cytometrie-Zeit-of-Flight (CyTOF)-Massenspektrometrie nachgewiesen. Aufgrund dieser Eigenschaften ermöglicht die Massenzytometrie die Multiplexerkennung von >40 verschiedenen Markern mit vorhandenen Plattformen10,11. Darüber hinaus ist es möglich, Barcode-Proben mit Metallen, die in der Einsparung von wertvollen Antikörpern führen, während Die Proben-zu-Probe-Färbungvariabilität reduziert wird. Auf der anderen Seite hat die Massenzytometrie mehrere Nachteile. Es gibt eine begrenzte Anzahl von handelsüblichen metallmarkierten Antikörpern für nicht blutbildende Zellen. Die Quantifizierung des DNA-Gehalts ist im Vergleich zur Verwendung fluoreszierender DNA-Farbstoffe weniger empfindlich, und die Massenzytometrie hat einen reduzierten Dynamikbereich der Signaldetektion im Vergleich zur Fluoreszenzflusszytometrie.
Das hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um die Zellzyklusdynamik von neu isolierten Keratinozyten (KCs) aus der Maushaut zu analysieren und die zellzyklusspezifische Proteinexpression in diesen Zellen mittels Massenzytometrie zu charakterisieren. Dieses Protokoll kann auch mit kultivierten Zellen verwendet oder an andere Zelltypen angepasst werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das in diesem Dokument beschriebene Protokoll kann in ca. 8 h abgeschlossen werden. Das Endergebnis ist eine Suspension von Zellen, die in KCs angereichert sind und auf zellzyklusabhängige Weise auf Proteinexpression analysiert werden können. Mehrere frühere Studien haben Methoden skizziert, um KCs von der menschlichen und Maushaut zu isolieren16,25. Diese Studien umfassen auch Protokolle zur Isolierung von KCs für die Durchflusszytometrie26…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unterstützung für diese Arbeit kam vom Department of Dermatology, dem Gates Center for Regenerative Medicine an der University of Colorado und der University of Colorado (UC) Skin Disease Center Morphology and Phenotyping Cores (NIAMS P30 AR057212). Die Autoren würdigen das UC Cancer Center Flow Cytometry Shared Resource and Support Grant (NCI P30 CA046934) für den Betrieb des Massenzytometers und sind Karen Helm und Christine Childs im Kern für ihre fachkundige Beratung zu Strömung und zytometrischer Masse dankbar. Techniken.
Materials
| 12-well plate | Cell Treat | 229512 | |
| Intercalator solution | Fluidigm | 201192A | 125 µM – Ir intercalator solution |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 30525-89-4 | 16 % PFA |
| Strainer cap flow tubes | Fisher/Corning | 352235 | 35 µm pore size |
| Cell sieve | Fisher | 22363547 | 40 μm pore size |
| Cell detatchment solution | CELLnTEC | CnT-ACCUTASE-100 | Accutase |
| Iodine Solution | ThermoFisher/Purdue | 67618-151-17 | Betadine 7.5%-iodine surgical scrub |
| Barcode permeabilization buffer | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| Barcodes | Fluidigm | 201060 | Cell-ID 20-Plex Pd Barcoding Kit |
| pH strips | EMD | 9590 | colorpHast |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | Dulbecco’s Modified Eagle Media |
| Fine forceps | Dumont & Fils | 0109-5-PO | Dumostar #5 |
| Curved precision forceps | Dumont & Fils | 0109-7-PO | Dumostar #7 |
| Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | EQ Four Element Calibration Beads |
| HBSS | Gibco | 14175-095 | Hank's Balanced Salt Solution |
| Water | Fisher | SH30538.03 | Hyclone Molecular Biology grade water |
| Iododeoxyuridine | Sigma | I7125 | IdU |
| Cryo vials | ThermoFisher | 366656PK | internal thread |
| Cell Staining buffer | Fluidigm | 201068 | Maxpar Cell Staining buffer |
| Fix & Perm buffer | Fluidigm | 201067 | Maxpar Fix & Perm buffer |
| Fix I buffer | Fluidigm | 201065 | Maxpar Fix I buffer |
| Phosphate buffered saline | Rockland | MB-008 | Metal free 10x PBS |
| isopropanol-freezing container | ThermoFisher | 5100-0001 | Mr.Frosty |
| Sodium hydroxide | Fisher | BP359-500 | NaOH |
| Petri dish | Kord-Valmark | 2900 | Supplied by Genesee 32-107 |
| 15 mL conical | Olympus/Genesee | 28-101 | |
| 50 mL conical | Olympus/Genesee | 28-106 | |
| 6-well plate | Cell Treat | 229506 | |
| Cisplatin | Sigma | 479306 | |
| Dispase II | Sigma/Roche | 4942078001 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| Hydrochloric acid | Fisher | A144-212 | |
| Nuclear Antigen Staining permeabilization buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Nuclear Antigen Staining buffer | Fluidigm | 201063 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Tuberculin syringe | BD | 309626 | |
| Type IV Collagenase | Worthington Bioscience | CLSS-4 |
Referências
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