Een gedetailleerde instructies wordt beschreven op het bouwen van een sterk geneigd geveegd Tegel (HIST.) Microscoop en het gebruik ervan voor single-molecuul imaging.
Single-molecuul beeldvorming is sterk vooruitgegaan ons begrip van de moleculaire mechanismen in biologische studies. Echter is het uitdagend om het verkrijgen van grote veld-of-view, hoog-contrast beelden in dikke cellen en weefsels. Hier, invoeren we microscopie van de zeer geneigd rondlopende Tegel (HIST.) overwint van dit probleem. Een paar van cilindrische lenzen werd geïmplementeerd voor het genereren van een lichtbundel van langwerpige excitatie die werd gescand via een grote opnamegebied via een snelle galvo spiegel. Een 4f -configuratie werd gebruikt om de positie van optische componenten. Een wetenschappelijke complementary metal-oxide semiconductor-camera ontdekt de fluorescentie-signaal en de out-of-focus-achtergrond met een dynamische confocal gleuf gesynchroniseerd met het vegen van de lichtbundel wordt geblokkeerd. Presenteren we een stapsgewijze instructie op het opbouwen van de icoon-Microscoop met alle basiscomponenten.
Single-molecuul fluorescentie imaging speelt een belangrijke rol in vele biologische studies die ultrastructures, dynamiek en de hoeveelheid van biomoleculen1,2,3te onthullen. Echter heeft het is uitdagend om te studeren van single-moleculen binnen de cellen of weefsels. Terwijl confocale microscopie hoog vectorafbeeldingsbestanden vermogen4 biedt, is het niet geschikt voor single-molecuul imaging als gevolg van ernstige photobleaching door de hoge excitatie-intensiteit of trage imaging. Widefield microscopie zwakkere verlichting gebruikt maar lijdt aan een slecht signaal naar achtergrond verhouding (SBR)5. Licht vel microscopie, aan de andere kant kon laten zien goede segmenteren en lage photobleaching6; de beschikbare numerieke diafragma (nvt) wordt echter sterk beperkt door de eis van orthogonaal geplaatste doelstellingen7. U kunt ook vereist het speciale miniaturisten en monster chambers8,9.
Om deze redenen is zeer geneigd en gelamineerd optische blad (HILO) microscopie wijd verbeid gebruikt voor 3D-single-molecuul en imaging-10. Wanneer een geneigd lichtbundel tegenkomt een interface van twee media (glazen en water, bijvoorbeeld), wordt het licht gebroken volgens Snell de wet. Nog belangrijker is, de gebroken lichtstraal wordt dunner en de dikte wordt beschreven als dz = R/tan(θ) waarbij R is de diameter van de lichtbundel geneigd en θ de hoek van breking van het uitgezonden licht. Deze eenvoudige uitvoering resulteert in een goede vectorafbeeldingsbestanden vermogen. Deze relatie geeft echter aan dat een dunne verlichting (dat wil zeggen, hoog vectorafbeeldingsbestanden vermogen) een kleine R en/of een grote θ vereist. Bijvoorbeeld, wanneer R = 20 µm en θ = 72 graden, u kunt krijgen dz = 6.5 µm. Aangezien er een praktische limiet te verhogen op de hoek van breking oog beeld diep van binnen cellen en het vermijden van totale interne reflectie, is er een sterke koppeling van de verlichting-diameter en de dikte van de balk. Om deze reden toont HILO imaging een relatief kleine veld-of-view (FOV) die sterk zijn toepassingen in meercellige beeldbewerking beperkt.
Onlangs, hebben wij dit probleem opgelost door de microscopie van de zeer geneigd rondlopende Tegel (HIST.) waar de FOV is losgekoppeld van de dikte van de balk in een zeer eenvoudige manier11. Ten eerste, een bundel langwerpige in één richting wordt gegenereerd via een paar van cilindrische lenzen. Deze bundel, genoemd als een tegel, produceert een dunne verlichting met dz ~ 4 µm, terwijl de FOV is 130 x 12 µm2. Vervolgens is de tegel geveegd over het monster met behulp van een roterende galvo spiegel. Ondertussen is de fluorescentie-afbeelding opgenomen op een wetenschappelijke complementary metal-oxide semiconductor (sCMOS) camera die efficiënt out-of-focus achtergrond filtert met het opereren in een rollende sluitertijd modus die als afstembare confocal gleuf detectie fungeert. Op deze manier kunt HIST. microscopie single-molecuul beeldbewerking met een groter gezichtsveld (~ 130 x 130 µm2) en een dunner verlichting dan HILO imaging. Pasten we dit nieuwe imaging techniek voor het detecteren van RNA afschriften met één sonde in cellen of met een paar sondes in muis hersenen weefsels, die aanzienlijke potentieel heeft voor het bestuderen van genexpressie en ziekten. In tegenstelling tot andere benaderingen, HIST. telt slechts een enkele hoge numerieke diafragma doelstelling zonder een extra hulplicht of teledetectie doelstellingen en is volledig compatibel met omgekeerde microscopen. Deze voordelen samen met een grote FOV en hoog contrast zorgt HIST. microscopie een prominente instrument in de biologie en de geneeskunde. Presenteren wij gedetailleerde instructies met betrekking tot de instrumentatie van de icoon-Microscoop, en hoe om te testen en kalibreren van de prestaties zoals hieronder.
Er zijn twee belangrijke stappen in dit protocol. De eerste is de juiste plaatsing van L4 in stap 3.3, ervoor te zorgen dat de invallende lichtbundel door het midden van de lens loopt en een perfecte luchtige schijf patroon wordt gevormd op het plafond. De positie van L4 bepaalt de plaatsing van alle andere optische componenten, met inbegrip van M5, L2, L3 en GM. De tweede belangrijke stap is het synchronisatieproces. Om te weigeren de out of focus achtergrond, moeten actieve pixel waarvan doeltreffende opsporing de breedte gelijk aan de breedte van de tegel is worden gesynchroniseerd met de lichtbundel vegen. Daarom is het noodzakelijk om de breedte van het effectieve verlichting van een tegel lichtbundel (stap 5.6) meten en stel de camera parameters dienovereenkomstig in stap 6.4.
Wanneer imaging met zeer grote FOV, toont de onderhavige methode een verhoogde achtergrond aan één zijde ten opzichte van de andere kant. Dit wordt toegeschreven aan enigszins anders hoeken van verlichting op verschillende posities van de beeldvorming. Uitvoering van een tweede galvo spiegel in plaats van M5 vermindert dit probleem zoals aangetoond voordat door de positie en het scannen hoek11synchroon aan te passen. In plaats van off-the-shelf Achromatische paren zal een telecentrische scan lens ook nuttig zijn. Echter, voor een opnamegebied van < 8,080 µm2, één galvo spiegel vegen volstond. HIST. microscopie heeft een limiet van de beeldvorming diepte is echter het kunnen verkrijgen van een goede SBR wanneer imaging tot ~ 15 µm met een straal van 12 µm tegel en een nb 1.45 olie immersie objectief11.
In dit protocol gebruikten we een lichtbundel compressie-ratio van 8 om de straal van een tegel te maken. Een dunnere verlichting kan worden gebruikt in HIST. microscopie om hogere SBR, die misschien wel krachtig voor single-molecuul weefsel imaging11. Echter, in dit geval photobleaching effect moet worden beschouwd door een verhoogde excitatie-intensiteit terwijl de huidige lichtbundel compressieverhouding verminderde photobleaching in 3D imaging in vergelijking met de Epi-11 toonde. In vergelijking met licht vel microscopen met twee orthogonaal geplaatste doelstellingen, is HIST. microscopie eenvoudig te implementeren en compatibel met conventionele staalvoorbereiding. De verbeterde SBR en grote FOV van HIST. microscopie is geschikt voor het bestuderen van de interacties en de dynamiek van één biomoleculen in meerdere cellen en verder kan worden gebruikt in super resolutie beeldvorming en het bijhouden van de single-molecuul.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) (HR00111720066) en de National Science Foundation (NSF) (1805200). Wij danken Michael Serge in Andor technologie voor royaal lenen van de sCMOS camera.
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-060-A-ML | Collimator |
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-100-A-ML | L1,L2 |
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-300-A-ML | TL |
1" Broadband Dielectric Mirrors | Thorlabs | BB1-E02-10 | M1~M7 |
1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1363RM-A | CL1 |
1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1695RM-A | CL2 |
1" square kinematic mount | Edmund Optics | 58-857 | For dichroic mirror mounting |
1" Threaded Cage Plate | Thorlabs | CP02 | For holding other lenses |
2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-150-A-ML | L3 |
2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-400-A-ML | L4 |
2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01 | For holding L4 |
2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01T | For holding L3 |
2% Bis Solution | Bio Rad | 64085292 | hydrogel component |
20 nm fluorescent beads | Thermo Fisher | F8782 | For testing imaging |
30 mm Cage Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KCB1 | For objective & camera mounting |
30mm Cage System Iris | Thorlabs | CP20S | |
3-Axis NanoMax Stage | Thorlabs | MAX311D | |
40% Acrylamide Solution | Bio Rad | 64148001 | hydrogel component |
405 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
50x TAE buffer | Bio-Rad | 161-0743 | hydrogel component |
561 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-DPL | |
638 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
Ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | hydrogel component |
Beam alignment tool | custom made | ||
BNC terminal blocks | Natural Instruments | BNC-2110 | |
Cage plate with M9 x 0.5 internal threads | Thorlabs | CP1TM09 | For holding aspheric lens |
Cage System Rods | Thorlabs | SR series | |
Cell culture & smFISH | See a reference [11] | ||
Double side tape | Scotch | 515182 | Flow chamber |
Epoxy | Devcon | 14250 | Flow chamber |
Galvo mirror | Thorlabs | GVS211 | GM |
Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | |
Half wave plate | Thorlabs | WPH10M-405/561/633 | Power adjustment |
long-pass dichroic mirror | Chroma | T550lpxr | For combining lasers |
Microscope slides | Fisherbrand | 12549-3 | Flow chamber |
Mikroskopische Deckglaser | Hecht Assistent | 990/5024 | Flow chamber |
Mounted Frosted Glass Alignment Disk | Thorlabs | DG10-1500-H1-MD | For double pinhole system |
Mounted rochester aspheric lens | Thorlabs | A230TM-A | |
Multi-band dichroic mirror | Semrock | Di03-R405/488/561/635-t3 | DM; 3 mm thickness |
Multi-band filter | Semrock | FF01-446/523/600/677-25 | BF |
Multimode fiber | Thorlabs | M31L02 | MMF |
N,N,N',N'-tetramethyl ethylenediamine | Sigma | T7024-25ML | hydrogel component |
NI-DAQ board | Natural Instruments | PCI-6733 | |
Ø1" Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KM100 | For holding mirrors |
Objective lens | Olympus | PLANAPO N 60X | 60X 1.45NA oil |
Pedestal Base Clamping Forks | Newport | 9916 | |
Pedestal Pillar Posts | Thorlabs | RS1P8E | |
Piezo controller | Thorlabs | BPC303 | |
Polarized beam splitter | Thorlabs | PBS251 | For combining lasers |
RMS-SM1 adapter | Thorlabs | SM1A3TS | For objective lens |
Rod holder | custom made | ||
Rotation cage mount | Thorlabs | RSP1/CRM1/CRM1P | For HWP & cylindrical lens mounting |
sCMOS camera | Andor | Zyla-4.2P-CL10 | |
Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | Beam collimation test |
Single mode fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | SMF |
SM1 Lens Tubes | Thorlabs | SM1S25 | For double pinhole system |
SM1 Slotted Lens Tube | Thorlabs | SM1L30C | For double pinhole system |
Stage mount | custom made | ||
threaded fiber adapter | Thorlabs | SM1FC | |
Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | Fiber coupling |