En detaljeret instruktion er beskrevet på hvordan man opbygger en meget skrå fejet flise (HIST) mikroskop og dens skik for enkelt-molekyle imaging.
Enkelt-molekyle imaging har meget avancerede vores forståelse af de molekylære mekanismer i biologiske undersøgelser. Det har imidlertid været udfordrende at få store field-of-view, høj kontrast billeder med tykke celler og væv. Her introducerer vi stærkt tilbøjelig fejet flise (HIST) mikroskopi, der overvinder dette problem. Et par af cylindriske linser blev implementeret for at generere en aflang excitation stråle, der blev scannet over et stort billeddiagnostiske område via en hurtig galvo spejl. En 4f konfiguration blev brugt til at placere optiske komponenter. En videnskabelig komplementær metal-oxid halvleder kamera opdaget fluorescens signal og blokeret ud af fokus baggrund med en dynamisk Konfokal slids synkroniseret med beam fejende. Vi præsenterer en trinvis instruktion om bygning HIST mikroskop med alle grundlæggende komponenter.
Enkelt-molekyle fluorescens imaging spiller en vigtig rolle i mange biologiske undersøgelser, der afslører ultrastructures, dynamik og mængden af biomolekyler1,2,3. Dog har det udfordrende for at studere single-molekyler inde i celler eller væv. Mens konfokalmikroskopi giver høj skære kapacitet4, er det ikke egnet til enkelt-molekyle imaging på grund af alvorlige photobleaching ved høje excitation intensitet eller langsom imaging hastighed. Widefield mikroskopi bruger svagere belysning, men lider af et dårligt signal til baggrunden ratio (SBR)5. Lys-ark mikroskopi, på den anden side kunne vise god skæring og lav photobleaching6; tilgængelige numerisk blænde (NA) er dog stærkt begrænset af kravet om ortogonalt placerede mål7. Alternativt, det kræver særlige lysgivere og prøve kamre8,9.
Af disse grunde er meget hælder og laminerede optisk ark (HILO) mikroskopi almindeligt brugt til 3D enkelt-molekyle imaging10. Når en skrå strålen møder en grænseflade af to medier (glas og vand, for eksempel), brydes strålen ifølge Snells lov. Vigtigere, brydes strålen bliver tyndere, og dens tykkelse er beskrevet som dz = R/tan(θ) hvor R er tilbøjelig lysbundtets diameter og θ er brydning vinkel af den overførte stråle. Denne enkle gennemførelse resulterer i en god skæring kapacitet. Ikke desto mindre, denne relation angiver, at en tynd belysning (dvs. høj skære evne) kræver en lille R og/eller en stor θ. For eksempel, når R = 20 µm og θ = 72 grader, man kan opnå dz = 6,5 µm. Da der er en praktisk grænse til at øge brydning vinklen for at billede dybt inde i celler og undgå total interne reflection, er der en stærk kobling af belysning diameter og beam tykkelse. Af denne grund viser HILO imaging en relativt lille field-of-view (FOV) som stærkt begrænser sine programmer i flercellede billedbehandling.
For nylig har vi løse dette problem ved stærkt tilbøjelig fejet flise (HIST) mikroskopi hvor FOV er afkoblet fra beam tykkelse i en meget enkel måde11. Først, en stråle, aflange i én retning er genereret via et par af cylindriske linser. Denne stråle, betegnes som en flise, producerer en tynd belysning med dz ~ 4 µm, mens dens FOV er 130 x 12 µm2. Derefter, flisen er fejede hen over prøven ved hjælp af en roterende galvo spejl. I mellemtiden, fluorescens billedet er optaget på en videnskabelig komplementær metal-oxide semiconductor (sCMOS)-kamera, der filtrerer effektivt ud af fokus baggrund ved at operere i en rullende lukkertilstand, der tjener som afstemmelige Konfokal slids påvisning. På denne måde giver HIST mikroskopi enkelt-molekyle imaging med en større synsfelt (~ 130 x 130 µm2) og en tyndere belysning end HILO billeddannelse. Vi anvendte denne nye imaging teknik til at detektere RNA udskrifter med en enkelt sonde i celler eller med et par sonder i mus hjernen væv, som har et betydeligt potentiale for at studere genekspression og sygdomme. I modsætning til andre tilgange, HIST beskæftiger kun en enkelt høj numerisk blænde mål uden en yderligere illuminator eller sen detektion mål og er fuldt kompatibel med inverterede mikroskoper. Disse fordele sammen med en stor FOV og høj kontrast vil gøre HIST mikroskopi et fremtrædende redskab i biologi og medicin. Vi præsenterer detaljerede instruktioner om instrumentering HIST mikroskop, og hvordan man kan teste og kalibrere sin præstation som nedenfor.
Der er to vigtige skridt i denne protokol. Den første er den korrekt placering af L4 i trin 3.3, sikre, at det indfaldende strålebundt passerer gennem centrum af linsen og en perfekt luftig disk mønster er dannet i loftet. Placeringen af L4 bestemmer placeringen af alle de andre optiske komponenter, herunder M5, L3, GM og L2. Det andet vigtige skridt er synkroniseringsprocessen. For at afvise ude af fokus baggrund, skal aktive pixel hvis effektiv påvisning bredde er lig med den flise bredde synkroniseres med beam fejende. Derfor er det nødvendigt at måle effektiv belysning bredden af en flise stråle (trin 5.6) og sæt kameraet parametre i overensstemmelse hermed i trin 6.4.
Når imaging med meget store FOV, viser den præsenterede metode en øget baggrunden på en side i forhold til anden siden. Dette tilskrives lidt ændrede vinkler af belysning på forskellige imaging positioner. Gennemføre en anden galvo spejl i stedet for M5 lindrer problemet som påvist før af synkront justere holdning og den scanning vinkel11. Off-the-shelf akromatisk dubletter, vil en telecentrisk scan linse være også nyttigt. Men for billedbehandling et område af < 8,080 µm2, enkelt galvo spejl fejende var tilstrækkelig. HIST mikroskopi har en grænse på imaging dybden, men det er stand til at opnå en god SBR når imaging op til ~ 15 µm med en 12 µm flise stråle og en NA 1,45 olie fordybelse mål linse11.
I denne protokol brugte vi en stråle kompressionsforhold af 8 til at gøre en flise stråle. En tyndere belysning kan bruges i HIST mikroskopi til at opnå højere SBR, hvilket kan være kraftfuld for enkelt-molekyle væv imaging11. Men i dette tilfælde photobleaching virkning bør overvejes ved en øget excitation intensitet mens den nuværende beam kompressionsforhold viste reduceret photobleaching i 3D imaging sammenlignet med Epi11. I forhold til lys-ark mikroskoper med to retvinklet placerede mål, er HIST mikroskopi enkelt at implementere og kompatibel med konventionelle prøve præparater. Forbedret SBR og store FOV HIST mikroskopi er velegnet til at undersøge interaktioner og dynamikken i enkelt biomolekyler i flere celler og kan anvendes yderligere i Super-resolution imaging og enkelt-molekyle tracking.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) (HR00111720066) og National Science Foundation (NSF) (1805200). Vi takker Michael Serge i Andor Technology for generøst udlåner sCMOS kamera.
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-060-A-ML | Collimator |
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-100-A-ML | L1,L2 |
1" Achromatic doublet | Thorlabs | AC254-300-A-ML | TL |
1" Broadband Dielectric Mirrors | Thorlabs | BB1-E02-10 | M1~M7 |
1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1363RM-A | CL1 |
1" Cylindrical Lenses | Thorlabs | LJ1695RM-A | CL2 |
1" square kinematic mount | Edmund Optics | 58-857 | For dichroic mirror mounting |
1" Threaded Cage Plate | Thorlabs | CP02 | For holding other lenses |
2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-150-A-ML | L3 |
2" Achromatic doublet | Thorlabs | AC508-400-A-ML | L4 |
2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01 | For holding L4 |
2" Threaded Cage Plate | Thorlabs | LCP01T | For holding L3 |
2% Bis Solution | Bio Rad | 64085292 | hydrogel component |
20 nm fluorescent beads | Thermo Fisher | F8782 | For testing imaging |
30 mm Cage Right-Angle Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KCB1 | For objective & camera mounting |
30mm Cage System Iris | Thorlabs | CP20S | |
3-Axis NanoMax Stage | Thorlabs | MAX311D | |
40% Acrylamide Solution | Bio Rad | 64148001 | hydrogel component |
405 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
50x TAE buffer | Bio-Rad | 161-0743 | hydrogel component |
561 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-DPL | |
638 nm laser | Cobolt | Cobolt 06-MLD | |
Ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | hydrogel component |
Beam alignment tool | custom made | ||
BNC terminal blocks | Natural Instruments | BNC-2110 | |
Cage plate with M9 x 0.5 internal threads | Thorlabs | CP1TM09 | For holding aspheric lens |
Cage System Rods | Thorlabs | SR series | |
Cell culture & smFISH | See a reference [11] | ||
Double side tape | Scotch | 515182 | Flow chamber |
Epoxy | Devcon | 14250 | Flow chamber |
Galvo mirror | Thorlabs | GVS211 | GM |
Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | |
Half wave plate | Thorlabs | WPH10M-405/561/633 | Power adjustment |
long-pass dichroic mirror | Chroma | T550lpxr | For combining lasers |
Microscope slides | Fisherbrand | 12549-3 | Flow chamber |
Mikroskopische Deckglaser | Hecht Assistent | 990/5024 | Flow chamber |
Mounted Frosted Glass Alignment Disk | Thorlabs | DG10-1500-H1-MD | For double pinhole system |
Mounted rochester aspheric lens | Thorlabs | A230TM-A | |
Multi-band dichroic mirror | Semrock | Di03-R405/488/561/635-t3 | DM; 3 mm thickness |
Multi-band filter | Semrock | FF01-446/523/600/677-25 | BF |
Multimode fiber | Thorlabs | M31L02 | MMF |
N,N,N',N'-tetramethyl ethylenediamine | Sigma | T7024-25ML | hydrogel component |
NI-DAQ board | Natural Instruments | PCI-6733 | |
Ø1" Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | KM100 | For holding mirrors |
Objective lens | Olympus | PLANAPO N 60X | 60X 1.45NA oil |
Pedestal Base Clamping Forks | Newport | 9916 | |
Pedestal Pillar Posts | Thorlabs | RS1P8E | |
Piezo controller | Thorlabs | BPC303 | |
Polarized beam splitter | Thorlabs | PBS251 | For combining lasers |
RMS-SM1 adapter | Thorlabs | SM1A3TS | For objective lens |
Rod holder | custom made | ||
Rotation cage mount | Thorlabs | RSP1/CRM1/CRM1P | For HWP & cylindrical lens mounting |
sCMOS camera | Andor | Zyla-4.2P-CL10 | |
Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | Beam collimation test |
Single mode fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | SMF |
SM1 Lens Tubes | Thorlabs | SM1S25 | For double pinhole system |
SM1 Slotted Lens Tube | Thorlabs | SM1L30C | For double pinhole system |
Stage mount | custom made | ||
threaded fiber adapter | Thorlabs | SM1FC | |
Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | Fiber coupling |