תפוקה גבוהה המתיחה כוח מיקרוסקופ באמצעות PDMS מגלה השפעות תלויי מינון של שינוי מקדם הצמיחה-β על המעבר אפיתל-to-מעבר משנה
Summary
אנו מציגים את התפוקה הגבוהה כוח המתיחה שיטת המציא עם גומי סיליקון (PDMS). העיבוד החדשני הזה מתאים ללימוד שינויים פיזיים בתהליך ביולוגי ומחלות בתהליכים ביולוגיים וביורפואיים שונים. אנו מדגימים את כלי השירות של שיטה זו על-ידי מדידת העליה התלויה של TGF-β במהלך המעבר האפיתל-למסמצ’אל.
Abstract
הקונקטיאליות הסלולרית חיונית בהיבטים מגוונים של ביולוגיה, תהליכי נהיגה הנעים מתנועתיות וחילוק, להתכווצות רקמות ויציבות מכנית, ומייצגת יסוד מרכזי בחיי החיות הסלולאריות. בתאים חסיד, acto-רירן התכווצות נתפסת כוחות המתיחה כי תאים להפעיל על מצע שלהם. דיסרגולציה של כמובן הסלולר מופיעה במגוון של פתוגיות, ובכך מהווה יעד מבטיח בגישות אבחון מגוונות המשתמשות בביופיזיקה כמדד. יתר על כן, אסטרטגיות טיפוליות הרומן יכול להיות מבוסס על תיקון התקלה לכאורה של הקונקטיציות לתא. יישומים אלה, עם זאת, דורשים כימות ישירה של כוחות אלה.
פיתחנו סיליקון אלסטורר מבוססי כוח המתיחה מיקרוסקופ (TFM) בפורמט רב מקביל מרובה היטב. השימוש שלנו בגומי סיליקון, במיוחד polydiמתיל siloxane (PDMS), במקום נפוץ הידרוג’ל polyאקרילאמיד (צפות) מאפשר לנו לעשות מצעים חזקים ומלא מוגבל עם חיי מדף מוגדר לא דורש תנאי אחסון מיוחדים. בניגוד לגישות המבוססות על עמוד-PDMS שיש להן מודולוס בטווח הממוצע, ה-PDMS המשמש כאן הוא תואם מאוד, החל מ-0.4 kPa עד 100 kPa. אנו יוצרים פלטפורמת תפוקה גבוהה עבור tfm על ידי חלוקה אלה מונוליטי מונוליטיים גדולים מרחב לתוך בארות עצמאיות ביולוגי, יצירת פלטפורמה מרובת היטב עבור הקרנה כוח המתיחה כי הוא תואם עם מערכות מרובות היטב קיים.
בכתב יד זה, אנו משתמשים זה מערכת כוח המתיחה רב היטב כדי לבחון את האפיתל כדי Mesenchymal מעבר (חובש); אנו לגרום לפרמדיק בתאי NMuMG על ידי חשיפת אותם TGF-β, ו לכמת את השינויים ביופיזיים במהלך החובשים. אנו מודדים את הקונקטיציה כפונקציה של ריכוז ומשך החשיפה של TGF-β. הממצאים שלנו כאן להפגין את התועלת של TFM מקבילים בהקשר של ביופיזיקה מחלה.
Introduction
Acto-רירן הקונקטיטיות היא מרכיב חיוני של מכניקת התא הפעיל, להשפיע על התנהגויות תא מתוך תנועתיות והתפשטות לבידול תא גזע. ברקמות, כונני כוננים מפני הפרדת הקוטב בembryogenesis, לכיוון הפרדה בדרכי הנשימה ולפעילות לב. באופן ביקורתי, כדי ליצור מתח, התאים חייבים תחילה לדבוק הסביבה החילוץ שלהם. בפעולה זו, הדבר יוצר כוחות המתיחה על סביבתם. כוח המתיחה מיקרוסקופית (TFM) התפתחה בהמון צורות כדרך לכמת את הכוחות הללו מתאים מגוונים בתנאים שונים.
תחום ה-TFM ראה רוחב יוצא דופן של חדשנות ויישום, והתוצאות סללו את הדרך לפרספקטיבות חדשות בביולוגיה, המשלבות מכניקה וכוחות פיזיים. החל עם קמטים מצעים סיליקון1, החוקרים החילו טכניקות שונות כדי למדוד כוחות המתיחה תא. גישות אלה השתפרו ברציפות והגיעו כעת לרמה של רזולוציה על סדר של כמה מיקרון2. עם זאת, בעיה עיקרית אחת התפתחה, וזה הקושי ביצירת מצעים של נמוך כראוי מודוללי באמצעות סיליקונים זמין. כדי לעקוף בעיה זו, פוליאקרילאמיד אומץ כתחליף בשל קלות יצירת מצעים על סדר 1-20 kPa3. לאחרונה הטמיעה סיליקונים תואמי מאוד ב-TFM4, מה שמאפשר לנו להמציא את אותו מגוון של מודלי כמו פוליאקרילאמיד, אבל עם היתרונות של הסיליקון האינרטי והחזק.
גישות TFM אפשרו לתגליות מכנייות יקרות ערך, עם זאת, קיצור מתמשך הוא המורכבות שלהם, לעתים קרובות הגבלת השימוש שלהם לחוקרים בתחומי ההנדסה או המדעים הפיזיים. הדבר נובע בחלקו הגדול לחישובים הכיול והמאתגרים המפורטים הנדרשים לכמת. אתגר משמעותי נוסף הוא כי שיטות TFM הן במידה רבה תפוקה נמוכה ולכן מתאים ללמוד מצבים שונים או אוכלוסיות רבות בו5. זה הציג צוואר בקבוק, אשר העביר העברה של TFM מתוך הגדרת ביופיזיקה מומחה ליישומים ביולוגיים ותרופתי רחב יותר.
פיתחנו לאחרונה לוחית מרובת בפורמט TFM, אשר מאפשר לחוקרים למקביל מדידות TFM שלהם עבור כימות מהיר יותר של מדדי הקונקטיזציה, תוך חקירת ההשפעה של תרכובות שונות גם באמצעות פחות ריאגנטים4 . מתודולוגיה זו כוללת כלי שירות רחב במחקרים שונים של המכונה, מהערכת ההשפעות של תרכובות בפעילות הסלולר, כדי לכמת את השינויים הקונקטילה בידול או מחלה.
תחום אחד של מחקר ביו שיועיל מאוד מ TFM הוא המחקר של איך רמזים פיזיים השפעה על פנוטיפים ממאירים של תאים סרטניים. גרורה, אחראי 90% של מקרי מוות הקשורים לסרטן, מאופיין על ידי תאים סרטניים עוזב את אתר הגידול המקורי שלהם מטביל אתר משני. עבור תאים לעבור דרך הרקמה ולעבור פנימה והחוצה של מערכת כלי הדם, הם חייבים באופן קיצוני לשנות את הצורות שלהם כדי לסחוט את המחסומים הפיזיים האלה תוך יצירת כוחות משמעותיים כדי למשוך את דרכם לאורך מטריקס מסחטות או לנוע בין השני תאים. כוחות אלה מועברים למצע דרך אינטראקציות הדבקה מוקד2,3, וניתן לכמת באמצעות tfm. בעוד סרטן הם ביוכימית מגוונת במיוחד, עם רפרטואר המתרחב של מוטציות ידועות שינויי חלבון, כמה שינויים פיזיים נפוצים נצפו; במגוון של סרטן, כולל שד, ערמונית, סרטן הריאות, תאים גרורתי הוכחו להפעיל 2-3 פעמים כוחות המתיחה של תאים לא גרורתי6,7,8. תוצאות אלה מרמזות כי ייתכן שיש קורלציה חזקה בין התקדמות גרורתית וכוחות המתיחה המופעל על ידי תאים; עם זאת, קשה לבחון את השינויים תלויי הזמן המפורטים במהלך הבחינה.
המעבר האפיתל-ל-mesenchymal (חובש) הוא תהליך לפיו התאים להפחית חסיד והדוק הצומת מתווך התא תא הדבקה, להיות נדידה יותר פולשנית. בנוסף לפונקציות פיזיולוגיות הכוללות ריפוי בפצע ותהליכים התפתחותיים, הצוות החובש הוא גם תהליך מנוצל במהלך גרורות, מה שהופך אותו מערכת מודל שימושי כדי ללמוד את התהליך הזה. באמצעות TGF-β, אנחנו יכולים לגרום לחובש בתאי האפיתל של הפטמות של מורי (NMuMG)9 כדי לכמת ישירות את השינויים הפיזיים במהלך שינוי זה, ולאפיין את הזמן ואת ההשפעות התלויות במינון של tgf-β על החובשים וכלי הסלולר. במאמר זה, אנו מדגימים את כלי השירות של גישה זו על-ידי מדידת השינויים בתהליך הפעולה המושרה.
Protocol
Representative Results
Discussion
להצלחת שיטה זו, חיוני לקבל מדגם מצופה אחיד עם עובי קבוע של כ 100 μm. יש לבחור במודולולוס בקפידה כדי לבחון את המשמעות הפיזית של מערכת העניין הביולוגית. בעת בדיית שכבה עליונה, הריכוז של חלקיקי פלורסנט fiducial צריך להיות ממוטב לניתוח מדויק של הזחה וסטרס המתיחה. ניתוח תאים בודדים מבודדים דורש שכבת נ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לטום קוג’ר, מייקל לנדרי, וכריסטופר ג’יי בארט לקבלת סיוע בסינתזה של חרוזים. A.J.E. מכיר מדעי הטבע וההנדסה מענקי מחקר RGPIN/05843-2014 ו אקפקיו/472339-2015, מכונים קנדיים של מחקר הבריאות מענק no 143327, האגודה הקנדית לסרטן מענק no. 703930, והקרן הקנדית לחדשנות .32749 פרויקט רבי קריבנן מכיר במוסדות הבריאות הלאומיים לא. R21HL123522 ו R01HL136209. ח. י. הייתה נתמכת על-ידי כפות הטבע בקוויבק, ובעלי האופי הטבעי של מרכנצ’ה וטכנולוגיות קוויבק. המחברים מודים לג’והנסון על הסיוע בסרטון ובכתב היד ובזישין הוא לסיוע בהכנת הסרטון.
Materials
| Plate | |||
| GEL-8100 | Nusil Technology | GEL-8100 | High Purity Dielectric, Soft Silicone Gel kit |
| Dow Corning Sylgard 184 Silicone Encapsulant Clear 0.5 kg Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | curing agent |
| Custom Cut Glass | Hausser Scientific Company | 109.6mm± x 72.8mm± x 1mm thickness | |
| Target 2TM Nylon Syringe Filter | ThermoFisher Scientific | F2513-4 | |
| 96-well Stripwell Egg Crate Strip Holder | Corning | 2572 | |
| Polystyrene Universal Microplate Lid With Corner Notch | Corning | 3099 | |
| Ethyl alcohol | Greenfield Global | P016EA95 | 0.95 |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | 190764 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Surface Coating | |||
| Sulfo-SANPAH Crosslinker | Proteochem | c1111-100mg | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141-1MG | solution, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| PBS, 1X | Wisent | 319-005-CL | pH 7.4, without calcium and magnesium |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Cell Culture | |||
| DMEM, 1X | Wisent | 319-005-CL | 4.5g/L glucose, with L-glutamine, sodium pyruvate and phenol red |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Wisent | 080-150 | Premium Quality, Endotoxin <1, Hemoglobin <25 |
| HEPES | Wisent | 330-050-EL | 1M, free acid |
| Human Insulin Recombinant | Wisent | 511-016-CM | USP grade |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Wisent | 450-201-EL | 100 X, sterile filtered for cell culture |
| L-Glutamine solution | Wisent | 609-065-EL | 200mM solution, sterile filtered for cell culture |
| Amphotericine B | Wisent | 450-105-QL | 250μg/ml, sterile filtered for cell culture |
| Recombinant Human TGF-β1 | Peprotech | 100-21 | HEK293 Derived |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 537020 | Glacial, ≥99.85% |
| Cictric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | ACS reagent, ≥99.5% |
| NMuMG | ATCC | CRL-1636 | Mouse Mammary Gland Cell Line |
| Sodium azide | Fisher Schientific | AC190385000 | 99%, extra pure, ACROS Organics |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | ACS reagent, ≥85%, pellets |
| TritonX-100 | Sigma-Aldrich | X100 | laboratory grade |
| Bead Synthesis | |||
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma-Aldrich | 468495-100MG | 97% |
| Methyl methacrylate | Sigma-Aldrich | M55909-500ML | contains ≤30 ppm MEHQ as inhibitor, 99% |
| Inhibitor Remover | Sigma-Aldrich | 306312-1EA | Prepacked column for removing hydroquinone and monomethyl ether hydroquinone |
| Methacryloxylpropyl Terminated Polydimethylsiloxane | Gelest | DMS-R31 (25,000g/mol) | Polydimethylsiloxane stabilizer, 25,000g/mol, 1,000 cSt |
| 2,2′-Azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) | Sigma-Aldrich | 441090-25G | 98% |
| Hexane | Sigma-Aldrich | 296090-2L | anhydrous, 95% |
| Hexane, mixture of isomers | Sigma-Aldrich | 227064-1L | anhydrous, ≥99% |
| Whatman qualitative filter paper, Grade 1 | Sigma-Aldrich | WHA1001055 | circles, diam. 55 mm, |
| Equipment | |||
| Laurell WS-650Mz-23NPPB | Laurell Technologies | ||
| UVP Handheld UV Lamp Model UVGL-58 | VWR | 21474-622 | |
| Rheometer | Anton Paar | MCR 302 WESP | |
Referências
- Harris, A., Wild, P., Stopak, D. Silicone rubber substrata: a new wrinkle in the study of cell locomotion. Science. 208 (4440), 177-179 (1980).
- Oliver, T., Dembo, M., Jacobson, K. Traction forces in locomoting cells. Cell Motil Cytoskeleton. 31 (3), 225-240 (1995).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the Cell-to-Substrate Interface during Locomotion of Fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Yoshie, H., Koushki, N., et al. Traction Force Screening Enabled by Compliant PDMS Elastomers. Biophysical Journal. 114 (9), 2194-2199 (2018).
- Park, C. Y., Zhou, E. H., et al. High-throughput screening for modulators of cellular contractile force. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 7 (10), 1318-1324 (2015).
- Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS ONE. 7 (2), e32572 (2012).
- Agus, D. B., et al. A physical sciences network characterization of non-tumorigenic and metastatic cells. Scientific Reports. 3 (1), 1449 (2013).
- Guo, M., Ehrlicher, A. J., et al. Probing the Stochastic, Motor-Driven Properties of the Cytoplasm Using Force Spectrum Microscopy. Cell. 158 (4), 822-832 (2014).
- Ngan, E., Northey, J. J., Brown, C. M., Ursini-Siegel, J., Siegel, P. M. A complex containing LPP and alpha-actinin mediates TGFbeta-induced migration and invasion of ErbB2-expressing breast cancer cells. Journal of Cell Science. 126 (Pt 9), 1981-1991 (2013).
- Klein, S. M., Manoharan, V. N., Pine, D. J., Lange, F. F. Preparation of monodisperse PMMA microspheres in nonpolar solvents by dispersion polymerization with a macromonomeric stabilizer. Colloid & Polymer Science. 282 (1), 7-13 (2003).
