Визуализация Germinosomes и внутренняя мембрана в спор Bacillus subtilis
Summary
Germinant рецептор белков кластера в «germinosomes» в внутренняя мембрана спор Bacillus subtilis . Мы описываем протокол, с помощью супер резолюции микроскопии и флуоресцентных белков репортер для визуализации germinosomes. Протокол также идентифицирует споро внутренняя мембрана доменов, которые преимущественно окрашенных краской мембраны FM4-64.
Abstract
Небольшой размер спор и относительно низкой обилие всхожесть белков, вызывают трудности в их микроскопического анализа с помощью эпифлуоресцентного. Супер-резолюции трехмерной структурированного освещения микроскопии (3D-SIM) является перспективным инструментом для преодолеть этот барьер и выявить молекулярные детали процесса прорастания спор Bacillus subtilis (B. subtilis). Здесь, мы описывают использование модифицированных SIMcheck (ImageJ)-помощник 3D визуализации процесса и флуоресцентные репортер белков для SIM микроскопии спор B. subtilis germinosomes, появление всходов белков. Мы также представляем (стандарт) 3D-SIM изображений процедура FM4-64 пятнать B. subtilis споро мембран. С помощью этих процедур, мы получили непревзойденное разрешение для germinosome локализации и показать, что > 80% B. subtilis KGB80 спящие споры, полученные после заспорение на определенный минимальный средний MOPS имеют один или два Герд-GFP и GerKB-mCherry очаги. Светлые очаги были также наблюдается в FM4-64 витражные изображения 3D-SIM споры, предполагая, что внутренняя мембрана липидов домены различных текучести вероятно существуют. Дальнейшие исследования, которые используют двойной маркировки процедур с мембраной красителей и germinosome репортер белки для оценки сотрудничества локализации и таким образом получить оптимальный обзор организации Bacillus всхожесть белков в мембраны внутренние споры возможно.
Introduction
Споры по приказу Bacillales и Clostridiales метаболически неактивных и чрезвычайно устойчивы к суровым обеззараживания режимов, но если они прорастают, не может вызывать вредное воздействие на людей1. В питательных germinant срабатывает прорастания спор Bacillus subtilis (B. subtilis) инициирование событий является germinant привязку к germinant рецепторы (гр), расположенные в споро внутренняя мембрана (IM). Впоследствии гр передают сигналы на белок канала SpoVA, также расположенный в IM. Это приводит к начала обмена споро ядро пиридин-2,6-дикарбоновых кислота (dipicolinic кислота; DPA; состоит из 20% споро основной сухой wt) для воды через SpoVA канал. Впоследствии ДПВ релиз триггеров активации коры мукопептида гидролиза, а дополнительные воды следует за2,3,4. Эти события приводят к механическим воздействиям на слои пальто, его последующие разрыв, начала нарост и, наконец, вегетативного роста. Однако по-прежнему далеки от разрешаются точные детали молекулярный процесс прорастания.
Основной вопрос о прорастания спор касается биофизических свойств липидов, окружающих IM всхожесть белков, а также белки IM SpoVA канала. Это во многом неподвижной IM липидного бислоя является основным проницаемость барьером для многих маленьких молекул, включая токсичные химические консерванты, некоторые из которых оказывают их действий в споро ядро или вегетативная клетка цитоплазме5,6. IM липидный бислой, вероятно, в состоянии геля, хотя значительная часть мобильных липидов в IM5. Споро IM также имеет потенциал для значительного расширения5. Таким образом, 1,6 раза увеличивает площадь поверхности им после прорастания без дополнительных мембраны синтеза и сопровождается потерей этой мембраны характерным низкая проницаемость и липидов неподвижность5,6.
В то время как молекулярные детали активации белков всхожесть и организация им липидов в споры являются привлекательные темы для исследования, небольшой размер спор B. subtilis и относительно низкой обилие всхожесть белков, представляют собой вызов микроскопические анализы. Гриффитс et al. неопровержимые доказательства эпифлуоресцентного микроскопа, с использованием флуоресцентных репортеров, сливается с прорастания белков, свидетельствует о том, что в спор B. subtilis эшафот белка Герд организует три подразделения GR (A, B и C) для Гера, B и K гр, в кластер7. Они придумал термин «germinosome» для этого кластера всхожесть белков и назвал ~ 300 Нм большой IM белка очагов8структур. После начала прорастания спор, флуоресцентный germinosome очагов в конечном итоге превращаются в большие разогнать флуоресцентные шаблоны, с > 75% населения споро, отображение этот шаблон в споры проросшие за 1 час с L-валин8. Обратите внимание, что упомянутые выше используется бумага среднем изображения из десятков последовательных флуоресцентных изображений, чтобы получить статистическую мощность и преодолеть барьер низкой флуоресцентные сигналов во время визуализации. Это мысленное представление этих структур в бактериальных спор был на краю того, что является технически осуществимым с классической микроскопических инструменты и ни оценки количества очагов в одном spore ни была их более подробные субцеллюлярные локализации возможно с этим подходом.
Здесь мы продемонстрировать использование структурированных освещения микроскопии (SIM) для получения подробной визуализации и количественной оценки germinosome(s) в спор B. subtilis, а также их IM липидных доменов9. Протокол также содержит инструкции для заспорение, слайд подготовки и анализа изображений, SIMcheck (v1.0, плагинов imageJ) а также ImageJ10,,1112.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представил протокол содержит стандартный 3D-SIM процедуры для анализа FM4-64 окрашенных B. subtilis споры, включающий заспорение, подготовка слайдов и визуализации процессов. Кроме того, протокол описывает изменение SIMcheck (ImageJ)-при содействии 3D визуализации процесса для SIM микроскопии B. subt…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Christiaan Zeelenberg за его помощь во время визуализации SIM. JW признает Совет Китая стипендии PhD стипендии и спасибо Ирен Stellingwerf за ее помощь на начальном этапе обработки изображений.
Materials
| Air dried glass slides | Menzel Gläser | 630-2870 | |
| APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49) | |||
| B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan) | |||
| B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) | |||
| Erlenmeyer flasks 1 L | Sigma-Aldrich | Z567868 | |
| Erlenmeyer flasks 250 mL | Sigma-Aldrich | Z723088 | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres | Invitrogen, 0.1 μm | F8803 | |
| FM4-64 | Thermo Fisher Scientific | F34653 | |
| Histodenz nonionic density gradient medium | Sigma-Aldrich | D2158 | |
| Image J | |||
| iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera | Andor Technology | https://imagej.net/Welcome | |
| LB Agar | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Microfuge tubes 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 3451PK | |
| Microscope imaging software | Nikon, Japan | NIS-Element AR 4.51.01 | |
| MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water | Millipore | Milli-Q IQ 7003 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope | |||
| Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL | Thermo Fisher Scientific | 75003800 | |
| Precision Coverslips | Paul Marienfeld | 117650 | |
| Round Bottom tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM | |
| Screw cap tubes 50 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM |
Referências
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).
- Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -. Q. Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales. Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).
- Vepachedu, V. R., Setlow, P. Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).
- Setlow, P. Summer meeting 2013–when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).
- Cowan, A. E., et al. Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).
- Loison, P., et al. Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).
- Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster. Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).
- Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth. Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6, 27290 (2016).
- Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS One. 8 (3), e58972 (2013).
- Demmerle, J., et al. Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy. Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
- Bertani, G. STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).
- Pandey, R., et al. Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution. Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).
- Zheng, L., et al. Bacillus subtilis spore inner membrane proteome. Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).
- Vepachedu, V. R., Setlow, P. Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).
- Schouten, M., et al. Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Mukaka, M. M. A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research. Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).
- Stewart, K. A., Setlow, P. Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).
- Laflamme, C., et al. Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye. Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).
- Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).
- Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).
- Abhyankar, W. R., et al. The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores. Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).
- Rose, R., et al. Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates. Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).
- Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins. J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).
- Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -. q., Setlow, P. Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores. Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).
- Laue, M., Han, H. -. M., Dittmann, C., Setlow, P. Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination. Scientific Reports. 8, 11388 (2018).
- Strahl, H., Bürmann, F., Hamoen, L. W. The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane. Nature Communications. 5, (2014).
- Strahl, H., Hamoen, L. W. Membrane potential is important for bacterial cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).
- Swarge, B. N., et al. “One-Pot” sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores. Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).
