Visualizzazione di Germinosomes e la membrana interna in Bacillus subtilis spore
Summary
Cluster di proteine recettoriali germinant in ‘germinosomes’ nella membrana interna di spore di Bacillus subtilis . Descriviamo un protocollo utilizzando super risoluzione di microscopia e fluorescenti di proteine reporter per visualizzare germinosomes. Il protocollo identifica anche domini di membrana interna di spore che sono preferenzialmente colorate con il colorante di membrana FM4-64.
Abstract
Le piccole dimensioni delle spore e la relativamente bassa abbondanza di proteine di germinazione, causare difficoltà nelle loro analisi microscopiche mediante epifluorescenza. Microscopia di Super-risoluzione tridimensionale strutturato illuminazione (3D-SIM) è uno strumento promettente per superare questo ostacolo e rivelare i dettagli molecolari del processo di germinazione delle spore di Bacillus subtilis (Bacillus subtilis). Qui, descriviamo l’uso di un SIMcheck modificato (ImageJ)-processo di imaging 3D assistente e proteine reporter fluorescenti per microscopia SIM di germinosomes di b. subtilis spore, interumana delle proteine di germinazione. Presentiamo anche una procedura di imaging 3D-SIM (standard) per la colorazione delle membrane di spore di Bacillus subtilis FM4-64. Utilizzando queste procedure, abbiamo ottenuto la risoluzione insuperabile per la localizzazione di germinosome e mostrano che > 80% dei KGB80 di b. subtilis spore dormienti ottenute dopo la sporulazione su medium MOPS minimo definito hanno uno o due GerD-GFP e GerKB-mCherry fuochi. I fuochi luminosi erano anche osservato in FM4-64 macchiati immagini 3D-SIM spore suggerendo che domini lipidici della membrana interna di differenti fluidità probabile che esistano. Ulteriori studi che utilizzano la doppia etichettatura procedure con membrana coloranti e germinosome proteine reporter per valutare co-localizzazione e quindi ottenere una panoramica ottimale dell’organizzazione delle proteine di germinazione del bacillo nella membrana interna spora sono possibile.
Introduction
Spore degli ordini Bacillales e Clostridiales sono metabolicamente dormienti e straordinariamente resistente ai regimi di decontaminazione duro, ma a meno che non germinano, non possono causare effetti deleteri in esseri umani1. In nutrienti germinant innescata germinazione di spore di Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), l’evento di iniziazione è germinant legame ai recettori germinant (GRs) situato nella membrana interna di spore (IM). Successivamente, il GRs trasdurre segnali alla proteina canale SpoVA anche situato nel IM. Questo provoca l’inizio dello scambio di spora core piridina-2,6-dicarbossilico (acido dipicolinico; DPA; composto da 20% di spora core asciutto wt) per l’acqua tramite il canale di SpoVA. Successivamente, il rilascio DPA innesca l’attivazione di idrolisi di peptidoglicano di corteccia, e l’assorbimento di acqua supplementare segue2,3,4. Questi eventi conducono allo sforzo meccanico degli strati di cappotto, sua rottura successiva, l’insorgenza di conseguenza e, infine, lo sviluppo vegetativo. Tuttavia, lungi dal vengono risolti i dettagli molecolari del processo di germinazione.
Una domanda importante sulla germinazione delle spore riguarda le proprietà biofisiche dei lipidi che circonda le proteine di germinazione di IM come pure le proteine canale IM SpoVA. Questo doppio strato lipidico in gran parte immobile IM è la barriera di permeabilità principale per molte piccole molecole, tra cui conservanti chimici tossici, alcuni dei quali esercitano la loro azione nel nucleo di spora o cellula vegetativa citoplasma5,6. Il doppio strato lipidico IM è probabilmente in uno stato di gel, anche se c’è una frazione significativa dei lipidi mobile in IM5. IM della spora ha anche il potenziale per un’espansione significativa5. Quindi, l’area della superficie dell’IM aumenta 1.6-fold su germinazione senza sintesi ulteriori della membrana ed è accompagnata dalla perdita di questa membrana caratteristica bassa permeabilità e lipidica immobilità5,6.
Mentre i dettagli molecolari dell’organizzazione dei lipidi IM in spore e l’attivazione delle proteine di germinazione sono argomenti interessanti per lo studio, la piccola dimensione delle spore di Bacillus subtilis e l’abbondanza relativamente basso di proteine di germinazione, rappresentano una sfida per analisi al microscopio. Griffiths et al epifluorescenza microscopio prova coercitiva, utilizzando reporter fluorescenti fuso a proteine di germinazione, suggerisce che nel b. subtilis spore la proteina dell’impalcatura GerD organizza tre subunità GR (A, B e C) di GerA, B e K GRs, in un cluster7. Hanno coniato il termine ‘germinosome’ per questo cluster di proteine di germinazione e descritto le strutture come ~ 300 nm grande IM proteina fuochi8. All’inizio della germinazione delle spore, fluorescente germinosome i fuochi alla fine trasformarsi in grandi disperdere modelli fluorescente, con > 75% delle popolazioni di spora visualizzano questo modello in spore germinati per 1 h con L-valina8. Si noti che il libro citato sopra usate media immagini da decine di immagini consecutive fluorescente, per guadagnare potere statistico e superare l’ostacolo dei segnali fluorescenti Bassi osservato durante la formazione immagine. Questa visualizzazione di queste strutture in spore batteriche era ai margini di ciò che è tecnicamente fattibile con strumenti microscopici classici e né una valutazione della quantità di fuochi in una singola spora né era loro localizzazione subcellulare più dettagliate possibile con questo approccio.
Qui, dimostriamo che l’uso della microscopia di illuminazione strutturata (SIM) per ottenere una visualizzazione dettagliata e quantificazione di germinosome(s) le spore di Bacillus subtilis, nonché dei loro domini lipidici IM9. Il protocollo contiene anche le istruzioni per la sporulazione, la preparazione del vetrino e l’analisi di immagine di SIMcheck (v 1.0, un plugin di imageJ) così come ImageJ10,11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo presentato contiene una procedura di 3D-SIM standard per l’analisi di FM4-64 macchiato di spore di Bacillus subtilis che include la sporulazione, preparazione del vetrino e processi di imaging. Inoltre, il protocollo descrive un SIMcheck modificato (ImageJ)-assistita processo per microscopia SIM di germinosomes di spore di Bacillus subtilis etichettati con reporter fluorescenti di imaging 3D. La procedura di quest’ultima ci ha permesso di osservare questa sottostruttura dim con maggiore co…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Christiaan Zeelenberg per la sua assistenza durante l’imaging di SIM. JW riconosce il Consiglio di borsa di studio di Cina per una borsa di dottorato e grazie Irene Stellingwerf per il suo aiuto durante la fase primaria di imaging.
Materials
| Air dried glass slides | Menzel Gläser | 630-2870 | |
| APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49) | |||
| B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan) | |||
| B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) | |||
| Erlenmeyer flasks 1 L | Sigma-Aldrich | Z567868 | |
| Erlenmeyer flasks 250 mL | Sigma-Aldrich | Z723088 | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres | Invitrogen, 0.1 μm | F8803 | |
| FM4-64 | Thermo Fisher Scientific | F34653 | |
| Histodenz nonionic density gradient medium | Sigma-Aldrich | D2158 | |
| Image J | |||
| iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera | Andor Technology | https://imagej.net/Welcome | |
| LB Agar | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Microfuge tubes 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 3451PK | |
| Microscope imaging software | Nikon, Japan | NIS-Element AR 4.51.01 | |
| MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water | Millipore | Milli-Q IQ 7003 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope | |||
| Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL | Thermo Fisher Scientific | 75003800 | |
| Precision Coverslips | Paul Marienfeld | 117650 | |
| Round Bottom tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM | |
| Screw cap tubes 50 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM |
Referências
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).
- Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -. Q. Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales. Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).
- Vepachedu, V. R., Setlow, P. Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).
- Setlow, P. Summer meeting 2013–when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).
- Cowan, A. E., et al. Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).
- Loison, P., et al. Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).
- Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster. Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).
- Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth. Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6, 27290 (2016).
- Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS One. 8 (3), e58972 (2013).
- Demmerle, J., et al. Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy. Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
- Bertani, G. STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).
- Pandey, R., et al. Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution. Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).
- Zheng, L., et al. Bacillus subtilis spore inner membrane proteome. Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).
- Vepachedu, V. R., Setlow, P. Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).
- Schouten, M., et al. Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Mukaka, M. M. A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research. Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).
- Stewart, K. A., Setlow, P. Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).
- Laflamme, C., et al. Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye. Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).
- Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).
- Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).
- Abhyankar, W. R., et al. The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores. Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).
- Rose, R., et al. Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates. Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).
- Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins. J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).
- Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -. q., Setlow, P. Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores. Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).
- Laue, M., Han, H. -. M., Dittmann, C., Setlow, P. Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination. Scientific Reports. 8, 11388 (2018).
- Strahl, H., Bürmann, F., Hamoen, L. W. The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane. Nature Communications. 5, (2014).
- Strahl, H., Hamoen, L. W. Membrane potential is important for bacterial cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).
- Swarge, B. N., et al. “One-Pot” sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores. Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).
