Visualisatie van Germinosomes en het binnenste membraan in sporen van Bacillus subtilis
Summary
Germinant receptor eiwitten cluster in ‘germinosomes’ in het binnenste membraan van sporen van Bacillus subtilis . We beschrijven een protocol met behulp van super resolutie microscopie en TL verslaggever eiwitten om te visualiseren van germinosomes. Het protocol geeft ook spore binnenste membraan domeinen die zijn bij voorkeur gekleurd met de membraan kleurstof FM4-64.
Abstract
De geringe omvang van de sporen en de relatief lage abundantie van kiemkracht eiwitten, veroorzaken moeilijkheden in hun microscopische analyses met behulp van microscopie van epifluorescence. Super resolutie driedimensionale gestructureerde verlichting microscopie (3D-SIM) is een veelbelovende instrument om deze hindernis overwinnen en onthullen de moleculaire details van het proces van ontkieming van sporen van Bacillus subtilis (B. subtilis). Hier beschrijven we het gebruik van een gemodificeerde SIMcheck (ImageJ)-Assistent 3D imaging proces en fluorescerende verslaggever eiwitten voor SIM microscopie van B. subtilis sporen germinosomes, cluster (s) van kiemkracht eiwitten. Ook presenteren wij een procedure (standaard) 3D-SIM imaging voor FM4-64 kleuring van B. subtilis spore membranen. Met behulp van deze procedures, we verkregen onovertroffen resolutie voor germinosome lokalisatie en tonen aan dat > 80% van B. subtilis KGB80 slapende sporen na sporevorming op een gedefinieerde minimale MOPS voedingsbodem verkregen hebben één of twee GerD-GFP en GerKB-mCherry Foci. Heldere foci werden ook waargenomen in FM4-64 gekleurd sporen 3D-SIM beelden suggereren dat binnenste membraan lipide domeinen van verschillende vloeibaarheid waarschijnlijk bestaan. Verdere zijn studies die dubbele etikettering procedures met membraan kleurstoffen en germinosome verslaggever eiwitten gebruiken om te beoordelen co lokalisatie en dus krijgt een optimaal overzicht van de organisatie van Bacillus kiemkracht eiwitten in het membraan van de innerlijke spore mogelijk.
Introduction
Sporen van de orders, Bacillales en Clostridiales zijn metabolisch slapende en buitengewoon resistent tegen harde decontaminatie regimes, maar tenzij ze ontkiemen, geen schadelijke effecten in mens1. In voedende germinant geactiveerde kieming van sporen van Bacillus subtilis (B. subtilis) is de inleiding gebeurtenis germinant binding aan germinant receptoren (GRs) gelegen in de spore binnenste membraan (IM). Vervolgens transduce de GRs signalen aan de SpoVA kanaal proteïne ook gelegen in de IM. Dit resulteert in het begin van de uitwisseling van spore kern pyridine-2,6-dicarbon zuur (dipicolinic zuur; DPA; bestaande uit 20% van de spore kern dry wt) voor water via het SpoVA-kanaal. Vervolgens de release DPA activeert de activering van de cortex peptidoglycaan hydrolyse en extra water opname volgt2,3,4. Deze gebeurtenissen leiden tot mechanische belasting op de vacht lagen, zijn latere breuk, het begin van de uitgroei en, ten slotte, vegetatieve groei. De exacte moleculaire details van het proces van ontkieming zijn echter nog lang niet opgelost.
Een belangrijke vraag over spore kiemkracht betreft de biofysische eigenschappen van de vetten rondom de IM kiemkracht eiwitten evenals de IM SpoVA kanaal eiwitten. Deze grotendeels immobiel IM lipide dubbelgelaagde is de belangrijkste permeabiliteit barrière voor vele kleine molecules, met inbegrip van toxische chemische conserveringsmiddelen, waarvan sommige hun optreden in de kern van de spore of vegetatieve cel cytoplasma5,6 oefenen. De IM lipide dubbelgelaagde is waarschijnlijk in een gel staat, hoewel er een significante fractie van mobiele lipiden in de IM-5. De spore IM heeft ook het potentieel voor aanzienlijke uitbreiding5. Dus, de oppervlakte van de IM 1.6-fold verhoogt op kiemkracht zonder extra membraan synthese en gepaard gaat met het verlies van dit membraan de karakteristieke lage permeabiliteit en lipide immobiliteit5,6.
Hoewel de moleculaire details van de activering van kiemkracht eiwitten en organisatie van IM lipiden in sporen zijn aantrekkelijke onderwerpen voor studie, vormen de geringe omvang van B. subtilis sporen en de relatief lage overvloed van kiemkracht eiwitten, een uitdaging voor microscopische analyses. Griffiths et al. dwingende epifluorescence Microscoop bewijs, suggereert met behulp van fluorescerende verslaggevers aan kiemkracht eiwitten, gesmolten dat in B. subtilis sporen de steiger proteïne GerD organiseert drie GR subeenheden (A, B en C) voor de GerA, B en K GRs, in een cluster7. Zij bedacht de term ‘germinosome’ voor dit cluster van kiemkracht eiwitten en de structuren als ~ 300 nm groot IM eiwit foci8beschreven. Na de inleiding van spore kiemkracht, dispergeren fluorescerende germinosome foci uiteindelijk veranderen in grotere fluorescerende patronen, met > 75% van de populaties van de spore weergeven van dit patroon in sporen ontkiemd voor 1 h met L-valine8. Merk op dat het papier bovengenoemde gebruikte gemiddeld beelden uit tientallen opeenvolgende fluorescerende afbeeldingen, tot statistische macht bezaten en overwinnen van de horde van lage fluorescerende signalen waargenomen tijdens de beeldvorming. Deze visualisatie van deze structuren in bacteriële sporen was aan de rand van wat technisch haalbaar met klassieke microscopische tools en noch een evaluatie van de hoeveelheid foci in een enkele spore is noch hun meer gedetailleerde subcellular localisatie was mogelijk met deze aanpak.
Wij tonen hier, het gebruik van gestructureerde verlichting microscopie (SIM) te verkrijgen van een gedetailleerde visualisatie en kwantificering van de germinosome(s) in de sporen van B. subtilis, alsmede van hun IM lipide domeinen9. Het protocol bevat ook instructies voor de sporevorming, prepareren van objectglaasjes en beeldanalyse door SIMcheck (v1.0, een imageJ plugin) evenals ImageJ10,11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol gepresenteerd bevat een procedure van de standaard 3D-SIM voor analyse van FM4-64 gekleurd van B. subtilis sporen die sporevorming, prepareren van objectglaasjes en imaging processen omvat. Bovendien, het protocol beschrijft een gemodificeerde SIMcheck (ImageJ)-3D-imaging proces voor SIM microscopie van B. subtilis spore germinosomes gelabeld met de fluorescerende verslaggevers bijgestaan. De laatste procedure konden we observeren deze dim substructuur met verbeterde contrast. Door de koppe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Christiaan Zeelenberg voor zijn hulp tijdens de SIM beeldvorming. JW erkent de China Scholarship Council for een PhD fellowship en Irene Stellingwerf Bedankt voor haar hulp tijdens de primaire fase van de beeldvorming.
Materials
| Air dried glass slides | Menzel Gläser | 630-2870 | |
| APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49) | |||
| B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan) | |||
| B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) | |||
| Erlenmeyer flasks 1 L | Sigma-Aldrich | Z567868 | |
| Erlenmeyer flasks 250 mL | Sigma-Aldrich | Z723088 | |
| FluoSpheres carboxylate-modified microspheres | Invitrogen, 0.1 μm | F8803 | |
| FM4-64 | Thermo Fisher Scientific | F34653 | |
| Histodenz nonionic density gradient medium | Sigma-Aldrich | D2158 | |
| Image J | |||
| iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera | Andor Technology | https://imagej.net/Welcome | |
| LB Agar | Sigma-Aldrich | L2897 | |
| Microfuge tubes 1.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 3451PK | |
| Microscope imaging software | Nikon, Japan | NIS-Element AR 4.51.01 | |
| MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water | Millipore | Milli-Q IQ 7003 | |
| Nikon Eclipse Ti microscope | |||
| Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL | Thermo Fisher Scientific | 75003800 | |
| Precision Coverslips | Paul Marienfeld | 117650 | |
| Round Bottom tubes 15 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM | |
| Screw cap tubes 50 mL | Thermo Fisher Scientific | Nunc TM |
Referências
- Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).
- Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -. Q. Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales. Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).
- Vepachedu, V. R., Setlow, P. Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).
- Setlow, P. Summer meeting 2013–when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).
- Cowan, A. E., et al. Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).
- Loison, P., et al. Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).
- Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster. Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).
- Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth. Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6, 27290 (2016).
- Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS One. 8 (3), e58972 (2013).
- Demmerle, J., et al. Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy. Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).
- Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
- Bertani, G. STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).
- Pandey, R., et al. Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution. Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).
- Zheng, L., et al. Bacillus subtilis spore inner membrane proteome. Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).
- Vepachedu, V. R., Setlow, P. Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).
- Schouten, M., et al. Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Mukaka, M. M. A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research. Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).
- Stewart, K. A., Setlow, P. Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).
- Laflamme, C., et al. Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye. Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).
- Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).
- Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).
- Abhyankar, W. R., et al. The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores. Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).
- Rose, R., et al. Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates. Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).
- Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins. J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).
- Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -. q., Setlow, P. Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores. Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).
- Laue, M., Han, H. -. M., Dittmann, C., Setlow, P. Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination. Scientific Reports. 8, 11388 (2018).
- Strahl, H., Bürmann, F., Hamoen, L. W. The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane. Nature Communications. 5, (2014).
- Strahl, H., Hamoen, L. W. Membrane potential is important for bacterial cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).
- Swarge, B. N., et al. “One-Pot” sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores. Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).
