Imaging 3D ad alta risoluzione dell'infezione da virus della rabbia nel tessuto cerebrale con la rimozione del solvente
Summary
Nuove tecniche di sgombero dei tessuti immunostaining come l’ultima imaging 3D di organi autorizzati dai solventi consentono la visualizzazione 3D dell’infezione cerebrale da virus del virus della rabbia e del suo complesso ambiente cellulare. Le fette spesse di tessuto cerebrale etichettate con anticorpi sono rese otticamente trasparenti per aumentare la profondità di imaging e consentire l’analisi 3D mediante microscopia a scansione laser confocale.
Abstract
La visualizzazione dei processi di infezione nei tessuti e negli organi mediante immunoetichettatura è un metodo chiave nella moderna biologia delle infezioni. La capacità di osservare e studiare la distribuzione, il tropismo e l’abbondanza di agenti patogeni all’interno dei tessuti degli organi fornisce dati cardine sullo sviluppo e la progressione della malattia. Utilizzando metodi di microscopia convenzionali, l’immunoetichettatura è per lo più limitata a sezioni sottili ottenute da campioni conbloccati o congelati con paraffina. Tuttavia, il piano di immagine 2D limitato di queste sezioni sottili può portare alla perdita di informazioni cruciali sulla struttura complessa di un organo infetto e sul contesto cellulare dell’infezione. Le moderne tecniche di compensazione dei tessuti multicolore e immunostaining ora forniscono un modo relativamente veloce ed economico per studiare pile di immagini 3D ad alto volume di tessuto di organi infettati da virus. Esponendo il tessuto a solventi organici, diventa otticamente trasparente. Corrisponde agli indici di rifrazione del campione e alla fine porta a una significativa riduzione della diffusione della luce. Pertanto, in combinazione con obiettivi di lunga distanza di lavoro liberi, grandi sezioni di tessuto fino a 1 mm di dimensioni possono essere immagini dalla microscopia a scansione laser confocale convenzionale (CLSM) ad alta risoluzione. Qui, descriviamo un protocollo per applicare l’imaging dei tessuti profondi dopo la compensazione dei tessuti per visualizzare la distribuzione del virus della rabbia nei cervelli infetti al fine di studiare argomenti come la patogenesi del virus, la diffusione, il tropismo e la neuroinvasione.
Introduction
Le tecniche istologiche convenzionali si basano principalmente su sezioni sottili di tessuti di organi, che possono fornire intrinsecamente solo approfondimenti 2D in un ambiente 3D complesso. Anche se fattibile in linea di principio, la ricostruzione 3D da sezioni sottili seriali richiede tubazioni tecniche impegnative sia per il taglio che per il successivo allineamento in silico delle immagini acquisite1. Inoltre, la ricostruzione senza soluzione di continuità dei volumi z dopo il taglio dei microtomi è fondamentale in quanto gli artefatti meccanici e computazionali possono rimanere a causa della registrazione dell’immagine non ottimale causata da piani di immagine non sovrapposti, variazioni di colorazione e distruzione del tessuto, ad esempio, dalla lama del microtoma. Al contrario, la suddivisione ottica pura di campioni di tessuto spesso intatti consente l’acquisizione di piani di immagine sovrapposti (sovracampionamento) e, quindi, facilita la ricostruzione 3D. Questo, a sua volta, è altamente vantaggioso per l’analisi dei processi di infezione in popolazioni cellulari complesse (ad esempio, reti neuronali nel contesto delle cellule leali e immunitarie circostanti). Tuttavia, gli ostacoli intrinseci delle sezioni dei tessuti spessi includono la dispersione della luce e la limitata penetrazione degli anticorpi nel tessuto. Negli ultimi anni, una varietà di tecniche è stata sviluppata e ottimizzata per superare questi problemi2,3,4,5,6,7,8 , 9 (in vie , 10 del sistema , 11 Del sistema di , 12 mila , 13. In sostanza, i tessuti bersaglio vengono trasformatiotticamente trasparenti mediante trattamento con ,8,9 o organicsolvente-based10,11,12,13 soluzioni. L’introduzione di 3DISCO (3D imaging di organi con cancellazione del solvente)11,12 e il suo successore uDISCO (ultima imaging 3D di organi autorizzati solventi)13 ha fornito uno strumento relativamente veloce, semplice e poco costoso con eccellenti capacità di compensazione. I principali costituenti del protocollo di compensazione sono i solventi organici tert-butanol (TBA), l’alcol benzyl (BA), il benzyl benzoato (BB) e l’etere difenile (DPE). Lo sviluppo e l’aggiunta di iDISCO (immunolabeling-enabled 3D imaging of solvent-cleared organs)14, un protocollo di immunostaining compatibile, ha costituito un altro vantaggio rispetto ai metodi esistenti e ha permesso l’etichettatura dei tessuti profondi degli antigeni di interesse, nonché l’immagazzinamento a lungo termine di campioni immunostainsi. Pertanto, la combinazione di iDISCO14 e uDISCO13 consente l’imaging ad alta risoluzione di proteine con etichetta tura anticorpo in grandi sezioni di tessuto (fino a 1 mm) utilizzando CLSM convenzionale.
La conservazione della struttura complessa di un organo in tutte e tre le dimensioni è particolarmente importante per il tessuto cerebrale. I neuroni costituiscono una sottopopolazione cellulare molto eterogenea con morfologie 3D altamente diverse in base alle loro proiezioni neurite (riviste da Masland15). Inoltre, il cervello è costituito da un certo numero di compartimenti e sottocomparti, ciascuno composto da diverse sottopopolazioni cellulari e rapporti di essi, tra cui cellule gliali e neuroni (rivisto da von Bartheld et al.16). Come virus neurotropico, il virus della rabbia (RABV, recensito da Fooks et al.17) infetta principalmente i neuroni, utilizzando i loro macchinari di trasporto per viaggiare in retrogrado lungo gli assoni dal sito primario di infezione al sistema nervoso centrale (CNS). Il protocollo qui descritto (Figura 1A) consente il rilevamento e la visualizzazione assistita dall’immunostaining delle cellule infettate da RABV e RABV in grandi stack di immagini coerenti ottenuti da tessuto cerebrale infetto. Ciò consente una valutazione imparziale e 3D ad alta risoluzione dell’ambiente di infezione. È applicabile al tessuto cerebrale di una varietà di specie, può essere eseguito immediatamente dopo la fissazione o dopo lo stoccaggio a lungo termine di campioni in paraformaldeide (PFA), e consente lo stoccaggio e il reimaging di campioni macchiati e cancellati per mesi.
Protocol
Representative Results
Discussion
La rinascita e l’ulteriore sviluppo delle tecniche di sgombero dei tessuti negli ultimi anni2,3,4,5,6,7,8, 9 (in vie , 10 del sistema , 11 Del sistema di , 12…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Thomas C. Mettenleiter e Verena te Kamp per aver letto criticamente il manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Federal Excellence Initiative del Meclemburgo Western Pomerania e dal Fondo sociale europeo (FSE) Grant KoInfekt (ESF/14-BM-A55-0002/16) e da una sovvenzione di ricerca collaborativa inmurale sui Friedrich-Loeffler-Institute (Ri-0372).
Materials
| Reagents | |||
| Benzyl alcohol | Alfa Aesar | 41218 | Clearing reagent |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | BB6630-500ML | Clearing reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | 4720.2 | Various buffers |
| Diphenyl ether | Sigma-Aldrich | 240834-100G | Clearing reagent |
| DL-α-Tocopherol | Alfa Aesar | A17039 | Antioxidant |
| Donkey serum | Bio-Rad | C06SBZ | Blocking reagent |
| Glycine | Carl Roth | 3908.2 | Background reduction |
| Goat serum | Merck | S26-100ML | Blocking reagent |
| Heparin sodium salt | Carl Roth | 7692.1 | Background reduction |
| Hydrogen peroxide solution (30 %) | Carl Roth | 8070.2 | Sample bleaching |
| Methanol | Carl Roth | 4627.4 | Sample pretreatment |
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | Crystalline powder to make fixative solution |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | Prevention of microbial growth in stock solutions |
| tert-Butanol | Alfa Aesar | 33278 | Sample dehydration for tissue clearing |
| TO-PRO-3 | Thermo Fisher | T3605 | Nucleic acid stain |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.2 | Detergent |
| Tween 20 | AppliChem | A4974,0500 | Detergent |
| Miscellaneous | |||
| 5 mL reaction tubes | Eppendorf | 0030119401 | Sample tubes |
| Coverslip, circular (diameter: 22 mm) | Marienfeld | 0111620 | Part of imaging chamber |
| Coverslip, circular (diameter: 30 mm) | Marienfeld | 0111700 | Part of imaging chamber |
| Hypodermic needle (27 G x ¾” [0.40 mm x 20 mm]) | B. Braun | 4657705 | Filling of the imaging chamber with clearing solution |
| RTV-1 silicone rubber | Wacker | Elastosil E43 | Adhesive for the assembly of the imaging chamber |
| Ultimaker CPE 2.85 mm transparent | Ultimaker | 8718836374869 | Copolyester filament for 3D printer to print parts of the imaging chamber |
| Technical equipment and software | |||
| 3D printer | Ultimaker | Ultimaker 2+ | Printing of imaging chamber |
| Automated water immersion system | Leica | 15640019 | Software-controlled water pump |
| Benchtop orbital shaker | Elmi | DOS-20M | Sample incubation at room temperature (~ 150 rpm) |
| Benchtop orbital shaker, heated | New Brunswick Scientific | G24 Environmental Shaker | Sample incubation at 37 °C (~ 150 rpm) |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | DMI 6000 TCS SP5 | Inverted confocal microscope for sample imaging |
| Fiji | NIH (ImageJ) | open source software (v1.52h) | Image processing package based on ImageJ |
| Long working distance water immersion objective | Leica | 15506360 | HC PL APO 40x/1.10 W motCORR CS2 |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Sample slicing |
| Workstation | Dell | Precision 7920 | CPU: Intel Xeon Gold 5118 GPU: Nvidia Quadro P5000 RAM: 128 GB 2666 MHz DDR4 SSD: 2 TB |
| Primary antibodies | |||
| Goat anti-RABV N | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal goat anti-RABV N serum, generated by goat immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV nucleoprotein N Dilution: 1:400 |
|
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | Polyclonal antibody (RRID:AB_10013382) Dilution: 1:100 |
| Rabbit anti-MAP2 | Abcam | ab32454 | Polyclonal antibody (RRID:AB_776174) Dilution: 1:250 |
| Rabbit anti-RABV P 160-5 | Friedrich-Loeffler-Institut | Monospecific polyclonal rabbit anti-RABV P serum, generated by rabbit immunization with baculovirus-expressed and His-tag-purified RABV phosphoprotein P (see reference 23: Orbanz et al., 2010) Dilution: 1:1,000 |
|
| Secondary antibodies | |||
| Donkey anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
| Goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | depending on conjugated fluorophore | Highly cross-absorbed Dilution: 1:500 |
Referências
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