Een in vitro model voor het bestuderen van Tau-aggregatie met behulp van Lentiviral-gemedieerde transductie van menselijke neuronen

Summary

Dit protocol Details een procedure waarin menselijke neuronale culturen zijn transduced met lentiviral constructen codering voor Mutant Human tau. Transduced culturen weer te geven tau aggregaten en geassocieerde pathologieën.

Abstract

Afwijkende aggregatie van het eiwit tau is pathogeen betrokken bij een aantal neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer (AD). Hoewel de Muismodellen van tauopathy hebben een waardevolle bron voor het onderzoek van de neurotoxiciteit mechanismen van geaggregeerde tau, is het steeds duidelijker dat, als gevolg van interspecies verschillen in fysiologie, de muis hersenen is ongeschikt voor het modelleren van de menselijke conditie. Vooruitgang in de cel cultuur methoden hebben gemaakt menselijke neuronale culturen toegankelijk voor experimenteel gebruik in vitro en hebben geholpen bij de ontwikkeling van neurotherapeutics. Echter, ondanks de aanpassing van de menselijke neuronale cel culturen, in vitro modellen van de menselijke tauopathy zijn nog niet op grote schaal beschikbaar. Dit protocol beschrijft een cellulair model van Tau aggregatie waarin menselijke neuronen zijn transduced met lentiviral-afgeleide vectoren die code voor pathogene gemuteerde tau gesmolten tot een gele fluorescerende eiwit (YFP) verslaggever. Transduced culturen produceren tau aggregaten die positief vlek voor thioflavin en display markers van neurotoxiciteit, zoals verminderde axonale lengte en verhoogde lysosomale volume. Deze procedure kan een nuttig en kostenbesparend model zijn voor het bestuderen van menselijke therapeutische.

Introduction

Pathologische aggregatie van de microtubule-geassocieerde proteïne Tau is een bepalend kenmerk van vele neurodegeneratieve ziekten, waaronder AD, Frontotemporale dementie (FTD), de ziekte van pick, en Progressieve supranucleaire parese (PSP)¹. In een niet-zieke staat, tau bindt aan en stabiliseert microtubule filamenten in neuronale axonen². Echter, ziekte-geassocieerde hyperphosphorylation van Tau bevordert tau aggregatie, dissociatie van microtubuli, en neuronale toxiciteit³. De toxische effecten van geaggregeerde tau kan leiden tot afwijkende activering van cholinerge⁴ en glutamaterge receptoren⁵ resulteert in de ontregeling van intracellulaire calcium en, uiteindelijk, celdood. In diermodellen, de vermindering van de hersenen tau verbetert de pathologie in AD muizen⁶ en in muismodellen van repetitieve mild traumatisch hersenletsel⁷.

Montage bewijs toont aan dat de structuur en bindende affiniteit van muis-afgeleide tau zijn verschillend van de mens afgeleide tau en dat de muis Tau is ongeschikt voor het modelleren van de menselijke therapeutische⁸. Echter, menselijke cel tauopathy modellen zijn niet op grote schaal commercieel beschikbaar. Het algemene doel van dit werk is het beschrijven van een in vitro model van Tau aggregatie waarin menselijke neuronen worden transduced met lentiviral-afgeleide vectoren met Mutant menselijke tau constructen⁹. Tau aggregaat waardoor lentiviral constructen codeert voor de tau te herhalen domein harboring P301L en V337M mutaties gesmolten tot een YFP Reporter (tau-RDLM-YFP), terwijl de controle construeert code voor de wild-type (WT) tau herhalen domein gesmolten tot een YFP Reporter (tau-WT-YFP). Neuronale culturen transduced met behulp van deze methode Express ongeveer negen keer meer tau dan nontransduced culturen. Hoewel het bedrag van de tau-expressie overexpresse is ruwweg gelijk tussen tau-RDLM-YFP-en tau-WT-YFP-transduced cellen, alleen neuronen transduced met tau-RDLM-YFP display aggregaten. Culturen transduced met tau-RDLM-YFP vlek positief voor thioflavin en display reducties in axonale lengte en synaptische dichtheid. Daarom is dit cellulaire model kan een nuttig instrument voor het bestuderen van Tau aggregatie in vitro.

Protocol

1. bereiding van media en reagentia Ontdooi de kelder membraan matrix coating voor cultuur platen op 4 ° c (niet toestaan dat de kelder membraan matrix op te warmen of het zal stollen). Maak 1 mL hoeveelheid en bewaar ze bij-20 °C of-70 °C. Reconstrueren fundamentele fibroblastgroei factor (bFGF) in steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) op 10 µ g/mL en maak 10 µ L-hoeveelheid. Bewaar ze bij 4 °C. Om een nieuwe, ongeopende, 500 mL fles DMEM/F12 met glutamine, voeg B27 (10 mL),…

Representative Results

Tau-RDLM-YFP-transduced neuronen werden fluorescerend gelabeld met YFP, en RDLM-transduced culturen weergegeven aggregaten na transductie. Deze inclusies gekleurd positief voor thioflavin (Figuur 1). Zoals Figuur 1 aantoont, produceert dit protocol neuronale culturen die thioflavin-positieve tau aggregaten weergeven. Voor de eerste experimenten, is het aanbevolen dat neuronale differentiatie wordt bevestigd door immunolabeling de neuron-specifieke marker β-tubu…

Discussion

Dit protocol beschrijft de generatie van een in vitro model van de menselijke tauopathy dat vertoont zilver-vlek-positieve aggregaten en thioflavin-positieve neurofibrillaire klitten (NFTs). Bovendien, transduced cellen weer te geven tau-geïnduceerde pathologieën zoals morfologische gebreken, verminderde synaptogenese, en een verhoogd lysosomale volume. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het een toegankelijke en kosteneffectieve model van neuronale tauopathy, die kan worden gebruikt voor drug screening …

Materials

10 cm culture dishes	Thermofisher	12556002
15 ml tubes	Biopioneer	CNT-15
16% paraformaldehyde	Thermofisher	50-980-487
24 well culture plates	Thermofisher	930186
50ml tubes	Biopioneer	CNT-50
70% ethanol in spray bottle	Various sources	NA
B27 supplement	Thermofisher	17504044
Basement membrane matrix (Matrigel)	Corning	356231
Basic FGF	Biopioneer	HRP-0011
Bovine serum albumin	Sigma	A7906
Cell culture incubator	Various sources	NA
Centrifuge	Various sources	NA
DMEM-F12 culture media with glutamine	Thermofisher	10565042
Ethanol (50% concentration or higher)	Various sources	NA
Flourescently labeled secondary antibodies	Various Sources, experiment dependent	NA
Fluorescent microscope	Various sources	NA
Glass coverslips	Thermofisher	1254581
Glass slides	Thermofisher	12-550-15
Human neural stem cells	Various sources	NA
Lentiviral vectors	Various sources	custom order
Mounting media	Thermofisher	P36934
N2 supplement	Thermofisher	17502048
Penicillin-Streptomycin	Thermofisher	15140122
Phosphate buffered saline	Thermofisher	14190250
Primary antibodies	Various Sources, experiment dependent	NA
Rocking or rotating platform	Various sources	NA
Sterile cell culture hood	Various sources	NA
Thioflavin S	Sigma	T1892-25G
Triton X-100	Thermofisher	BP151-100
Water bath	Various sources	NA