Un modèle in vitro pour étudier l’agrégation de Tau à l’aide de la transduction à médiation Lentivirale des neurones humains

Summary

Ce protocole détaille une procédure dans laquelle les cultures neuronales humaines sont transproduites avec des constructions Lentivirales codant pour le tau humain mutant. Les cultures transproduites présentent des agrégats Tau et des pathologies associées.

Abstract

L’agrégation aberrante de la protéine tau est pathogénique impliquée dans un certain nombre de maladies neurodégénératives, y compris la maladie d’Alzheimer (AD). Bien que les modèles de souris de la tauopathie ont fourni une ressource précieuse pour enquêter sur les mécanismes neurotoxiques de Tau agrégé, il devient de plus en plus évident que, en raison de différences interespèces dans la neurophysiologie, le cerveau de la souris est inapproprié pour modélisation de la condition humaine. Les progrès dans les méthodes de culture cellulaire ont rendu les cultures neuronales humaines accessibles pour une utilisation expérimentale in vitro et ont aidé au développement de la neurothérapeutique. Cependant, malgré l’adaptation des cultures cellulaires neuronales humaines, les modèles in vitro de la tauopathie humaine ne sont pas encore largement disponibles. Ce protocole décrit un modèle cellulaire d’agrégation Tau dans lequel les neurones humains sont transgéniques avec des vecteurs LENTIVIRAUX qui code pour Tau pathogène mutant fusionné à une protéine fluorescente jaune (YFP) reporter. Les cultures transproduites produisent des agrégats tau qui coloraient positivement la thioflavine et affichaient des marqueurs de neurotoxicité, comme une diminution de la longueur axonale et une augmentation du volume lysosomique. Cette procédure peut être un modèle utile et rentable pour l’étude des tauopathies humaines.

Introduction

L’agrégation pathologique de la protéine tau associée aux microtubules est une caractéristique déterminante de nombreuses maladies neurodégénératives, y compris la maladie d’Alzheimer, la démence frontotemporelle (FTD), le prélèvement et la paralysie supranucléaire progressive (PSP)¹. Dans un État non malade, TAU se lie et stabilise les filaments microtubules dans les axones neuronaux². Cependant, l’hyperphosphorylée de Tau associée à la maladie favorise l’agrégation Tau, la dissociation des microtubules et la toxicité neuronale³. Les effets toxiques du Tau agrégé peuvent impliquer une activation aberrante des récepteurs cholinergiques⁴ et glutamatergiques⁵ entraînant une dysrégulation du calcium intracellulaire et, finalement, la mort cellulaire. Dans les modèles animaux, la réduction du Tau cérébral améliore la pathologie chez les souris AD⁶ et dans les modèles de souris de lésions cérébrales traumatiques légères répétitives⁷.

La preuve de montage démontre que la structure et l’affinité de liaison des Tau dérivées de la souris sont distinctes des Tau dérivées de l’homme et que la souris Tau n’est pas apte à modéliser les tauopathies humaines⁸. Cependant, les modèles de tauopathie cellulaire humaine ne sont pas largement disponibles dans le commerce. L’objectif général de ce travail est de décrire un modèle in vitro d’agrégation Tau dans lequel les neurones humains sont transduit avec des vecteurs LENTIVIRAUX contenant des constructions Tau humaines mutantes⁹. L’agrégat Tau causant des constructions Lentivirales encode pour le domaine de répétition Tau P301L et V337M mutations fusionnées à un reporter YFP (Tau-RDLM-YFP) tandis que le contrôle construit le code pour le domaine de répétition de type Wild (WT) Tau fusionné avec un reporter YFP (Tau-WT-YFP). Les cultures neuronales transproduites à l’aide de cette méthode expriment environ neuf fois plus de Tau que les cultures non transproduites. Bien que la quantité d’expression Tau surexprimée soit à peu près égale entre les cellules transproduites Tau-RDLM-YFP-et Tau-WT-YFP, seuls les neurones transprésentés avec des agrégats d’affichage Tau-RDLM-YFP. Les cultures transproduites avec Tau-RDLM-YFP tache positivement pour la thioflavine et affichent des diminutions de la longueur axonale et de la densité synaptique. Par conséquent, ce modèle cellulaire peut être un outil utile pour étudier l’agrégation Tau in vitro.

Protocol

1. préparation des supports et des réactifs Décongeler le revêtement matriciel de la membrane sous-sol pour les plaques de culture à 4 ° c (ne pas laisser la matrice de la membrane sous-sol se réchauffer ou se solidifier). Faire 1 mL d’aliquotes et les entreposer à-20 ° c ou-70 ° c. Reconstituer le facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) à 10 μg/mL et faire 10 μL d’aliquotes. Rangez-les à 4 ° c. …

Representative Results

Les neurones transducteurs Tau-RDLM-YFP ont été marqués fluorescemment avec le YFP, et les cultures transproduites par RDLM ont affiché des agrégats après la transduction. Ces inclusions se sont colorées positivement pour la thioflavine (figure 1). Comme le montre la figure 1 , ce protocole produit des cultures neuronales qui présentent des agrégats Tau thioflavine-positifs. Pour les expériences initiales, il est recommandé que la différenciation neu…

Discussion

Ce protocole décrit la génération d’un modèle in vitro de tauopathie humaine qui présente des agrégats d’argent-tache-positif et des enchevêtrements neurofibrillaires positifs de thioflavine (NFTS). En outre, les cellules transproduites présentent des pathologies induites par le tau telles que des anomalies morphologiques, une réduction de la synaptogenèse et un volume lysosomique accru. Le principal avantage de ce protocole est qu’il fournit un modèle accessible et rentable de la tauopathie neuronale, q…

Materials

10 cm culture dishes	Thermofisher	12556002
15 ml tubes	Biopioneer	CNT-15
16% paraformaldehyde	Thermofisher	50-980-487
24 well culture plates	Thermofisher	930186
50ml tubes	Biopioneer	CNT-50
70% ethanol in spray bottle	Various sources	NA
B27 supplement	Thermofisher	17504044
Basement membrane matrix (Matrigel)	Corning	356231
Basic FGF	Biopioneer	HRP-0011
Bovine serum albumin	Sigma	A7906
Cell culture incubator	Various sources	NA
Centrifuge	Various sources	NA
DMEM-F12 culture media with glutamine	Thermofisher	10565042
Ethanol (50% concentration or higher)	Various sources	NA
Flourescently labeled secondary antibodies	Various Sources, experiment dependent	NA
Fluorescent microscope	Various sources	NA
Glass coverslips	Thermofisher	1254581
Glass slides	Thermofisher	12-550-15
Human neural stem cells	Various sources	NA
Lentiviral vectors	Various sources	custom order
Mounting media	Thermofisher	P36934
N2 supplement	Thermofisher	17502048
Penicillin-Streptomycin	Thermofisher	15140122
Phosphate buffered saline	Thermofisher	14190250
Primary antibodies	Various Sources, experiment dependent	NA
Rocking or rotating platform	Various sources	NA
Sterile cell culture hood	Various sources	NA
Thioflavin S	Sigma	T1892-25G
Triton X-100	Thermofisher	BP151-100
Water bath	Various sources	NA