एक्सक्पेंशन-स्कैनिंग हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग माइक्रोस्कोपी को कुशलता से फ्लुओरेंस सिग्नलों को भेदभाव करने के लिए
Summary
स्पेक्ट्रल इमेजिंग एक ही नमूने में कई फ्लोरोसेंट संकेतों की पहचान और जुदाई के लिए एक विश्वसनीय समाधान बन गया है और आसानी से पृष्ठभूमि या autofluorscence से ब्याज के संकेतों को अलग कर सकते हैं। उत्तेजना-स्कैनिंग हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग आवश्यक छवि अधिग्रहण समय को कम करके इस तकनीक पर सुधार करती है, जबकि साथ ही सिग्नल-टू-शोर अनुपात में वृद्धि करती है।
Abstract
कई तकनीकों की पहचान करने या घटना का अध्ययन करने के लिए या कार्यों को स्पष्ट करने के लिए फ्लोरोसेंट संकेतों का पता लगाने पर भरोसा करते हैं। इन फ्लोरोसेंट संकेतों का पृथक्करण हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग के आगमन तक बोझिल साबित हुआ, जिसमें फ्लोरोसेंट स्रोतों को एक दूसरे से अलग किया जा सकता है और साथ ही पृष्ठभूमि संकेतों और ऑटोफ्लोरेसीसेंस (अपने वर्णक्रमीय का ज्ञान दिया गया है) हस्ताक्षर)। हालांकि, पारंपरिक, उत्सर्जन स्कैनिंग हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग धीमी अधिग्रहण समय और कम संकेत-से-शोर अनुपात दोनों उत्तेजना और उत्सर्जन प्रकाश की आवश्यक फ़िल्टरिंग के कारण से ग्रस्त है। यह पहले से दिखाया गया है कि उत्तेजना स्कैनिंग hyperspectral इमेजिंग आवश्यक अधिग्रहण समय कम कर देता है, जबकि एक साथ प्राप्त डेटा के संकेत से शोर अनुपात में वृद्धि. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों का उपयोग करना, इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे इकट्ठा करने के लिए, जांचना, और एक ही नमूने में कई फ्लोरोसेंट स्रोतों से संकेतों की जुदाई के लिए एक उत्तेजना स्कैनिंग hyperspectral इमेजिंग माइक्रोस्कोपी प्रणाली का उपयोग करें. जबकि कोशिकाओं और ऊतकों के सूक्ष्म इमेजिंग के लिए अत्यधिक लागू है, इस तकनीक भी फ्लोरोसेंट का उपयोग प्रयोग के किसी भी प्रकार के लिए उपयोगी हो सकता है जिसमें यह उत्तेजना तरंगदैर्ध्य भिन्न करने के लिए संभव है, सहित, लेकिन तक सीमित नहीं: रासायनिक इमेजिंग, पर्यावरण अनुप्रयोगों, नेत्र देखभाल, खाद्य विज्ञान, फोरेंसिक विज्ञान, चिकित्सा विज्ञान, और खनिज विज्ञान.
Introduction
स्पेक्ट्रल इमेजिंग विभिन्न तरीकों से की जा सकती है और इसे अनेक शब्दों1,2,3,4द्वारा निर्दिष्ट किया जाता है . सामान्य तत्त्क्षणीय इमेजिंग कम से कम दो स्थानिक आयामों और एक वर्णक्रमीय आयाम में प्राप्त डेटा को निर्दिष्ट करता है। बहुस्पेक्ट्रल और हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग अक्सर तरंगदैर्ध्य बैंडों की संख्या से अलग होती है या क्या वर्णक्रमीय बैंड समीपवर्ती1होते हैं। इस आवेदन के लिए, hyperspectral डेटा उत्तेजना के लिए इस्तेमाल किया प्रत्येक bandpass फिल्टर की आधी अधिकतम (FWHM) पर आधे से कम नहीं आधे से अधिक पूर्ण चौड़ाई केंद्र तरंगदैर्ध्य के अंतराल द्वारा प्राप्त निरंतर तरंगदैर्ध्य बैंड के साथ प्राप्त वर्णक्रमीय डेटा के रूप में परिभाषित किया गया है (यानी, 5 एनएम 14-20 एनएम बैंडविड्थ के साथ bandpass फिल्टर के लिए केंद्र तरंगदैर्ध्य रिक्ति) डेटा बैंड के निरंतर प्रकृति डेटासेट के एक oversampling के लिए अनुमति देता है, यह सुनिश्चित करना है कि NyQuist मापदंड संतुष्ट हैं जब वर्णक्रमीय डोमेन नमूना.
हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग को नासा द्वारा 1970 और 1980 के दशक में पहले लैंडसैट उपग्रह5,6के साथ संयोजन के रूप में विकसित किया गया था . कई आसन्न वर्णक्रमीय बैंड से डेटा एकत्र प्रत्येक पिक्सेल की एक चमक स्पेक्ट्रम की पीढ़ी की अनुमति दी. अलग-अलग घटकों की चमक स्पेक्ट्रम की पहचान और परिभाषित करने से न केवल उनकी विशेषता स्पेक्ट्रम द्वारा सतह सामग्री का पता लगाना संभव हो गया है, बल्कि यह हस्तक्षेप संकेतों को हटाने के लिए भी अनुमति देता है, जैसे कि सिग्नल में बदलाव के कारण वायुमंडलीय स्थितियों. उनकी विशेषता स्पेक्ट्रम का उपयोग कर सामग्री का पता लगाने की अवधारणा 1996 में जैविक प्रणालियों के लिए लागू किया गया था जब श्रेक एट अल. पांच अलग fluorophores और उनके ज्ञात spectra के संयोजन का इस्तेमाल किया एक प्रक्रिया में लेबल गुणसूत्रों भेद करने के लिए कहा वर्णक्रमीय कर्योटाइपिंग7| इस तकनीक पर विस्तार से किया गया था 2000 Tsurui एट अल द्वारा ऊतक के नमूने के फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए, सात फ्लोरोसेंट रंगों और विलक्षण मूल्य अपघटन का उपयोग करने के लिए संदर्भ में स्पेक्ट्रम के रैखिक संयोजन में प्रत्येक पिक्सेल के वर्णक्रमीय जुदाई को प्राप्त करने के लिए पुस्तकालय8| उनके रिमोट सेंसिंग समकक्षों के समान, प्रत्येक ज्ञात फ्लोरोफोर के योगदान की गणना हाइपरस्पेक्ट्रल छवि से की जा सकती है, प्रत्येक फ्लोरोफोर के स्पेक्ट्रम की एक प्राथमिकता जानकारी दी जाती है।
हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग का उपयोग कृषिकेक्षेत्रों में भी किया गया है 9 , खगोल विज्ञान10, बायोमेडिसिन11, रासायनिक इमेजिंग12, पर्यावरण अनुप्रयोग13, नेत्र देखभाल14, खाद्य विज्ञान15, फॉरेंसिक साइंस16,17, मेडिकल साइंस18, खनिजविज्ञान 19, और निगरानी20. वर्तमान फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप hyperspectral इमेजिंग सिस्टम की एक प्रमुख सीमा यह है कि मानक hyperspectral इमेजिंग प्रौद्योगिकी द्वारा संकीर्ण बैंड में फ्लोरोसेंट संकेतों को अलग 1) पहले नमूना उत्तेजना को नियंत्रित करने के लिए उत्तेजना प्रकाश छानने, तो 2) आगे छानने उत्सर्जित प्रकाश संकीर्ण बैंड है कि बाद में गणितीय21अलग किया जा सकता है में फ्लोरोसेंट उत्सर्जन को अलग करने के लिए। उत्तेजना रोशनी और उत्सर्जित फ्लोरोसेंट दोनों को फ़िल्टर करने से उपलब्ध सिग्नल की मात्रा कम हो जाती है, जो सिग्नल-टू-शोर अनुपात को कम करती है और लंबा अधिग्रहण समय आवश्यक है। कम संकेत और लंबा अधिग्रहण बार एक नैदानिक उपकरण के रूप में hyperspectral इमेजिंग की प्रयोज्यता सीमा.
एक इमेजिंग मोडलिटी विकसित की गई है जो हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग का उपयोग करती है लेकिन उपलब्ध सिग्नल को बढ़ा देती है, जिससे आवश्यक अधिग्रहण समय21,22को कम किया जा सकता है। इस नई मोडलिटी, जिसे उत्तेजना-स्कैनिंग हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग कहा जाता है, उत्तेजना तरंगदैर्ध्य को अलग करके और उत्सर्जित प्रकाश की एक विस्तृत श्रृंखला का संग्रह करके वर्णक्रमीय छवि डेटा प्राप्त करती है। यह पहले से दर्शाया गया है कि इस तकनीक से उत्सर्जन स्कैनिंग तकनीकों21,22की तुलना में संकेत-से-शोर अनुपात में परिमाण वृद्धि के आदेश प्राप्त होते हैं। सिग्नल-टू-शोर अनुपात में वृद्धि काफी हद तक उत्सर्जन प्रकाश के विस्तृत बैंडपास ($600 एनएम) के कारण हुई है, जबकि विशिष्टता फ्लोरोसेंट उत्सर्जन के बजाय केवल उत्तेजना प्रकाश को छानने के द्वारा प्रदान की जाती है। यह सभी उत्सर्जित प्रकाश की अनुमति देता है (हर उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के लिए) डिटेक्टर21तक पहुँचने के लिए. इसके अतिरिक्त, इस तकनीक exogenous लेबल से autofluorence भेदभाव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, वृद्धि की डिटेक्टेबल सिग्नल के कारण अधिग्रहण समय को कम करने की क्षमता photobleaching के खतरे को कम कर देता है और साथ ही एक अधिग्रहण दर है कि वर्णक्रमीय वीडियो इमेजिंग के लिए स्वीकार्य है पर वर्णक्रमीय स्कैन की अनुमति देता है.
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य उत्तेजना-स्कैनिंग hyperspectral इमेजिंग माइक्रोस्कोपी के लिए एक डेटा अधिग्रहण गाइड के रूप में सेवा करने के लिए है. इसके अतिरिक्त, वर्णन शामिल किए गए हैं जो प्रकाश पथ और हार्डवेयर को समझने में मदद करते हैं. यह भी वर्णित एक उत्तेजना स्कैनिंग hyperspectral इमेजिंग माइक्रोस्कोप के लिए खुला स्रोत सॉफ्टवेयर के कार्यान्वयन है. अंत में, विवरण कैसे एक NIST-ट्रेसकरनेयोग्य मानक करने के लिए प्रणाली जांचना, सटीक परिणाम के लिए सॉफ्टवेयर और हार्डवेयर सेटिंग्स को समायोजित करने के लिए प्रदान की जाती हैं, और अलग-अलग घटकों से योगदान में पता चला संकेत unmix.
Protocol
Representative Results
Discussion
एक उत्तेजना स्कैनिंग hyperspectral इमेजिंग सेट अप का इष्टतम उपयोग प्रकाश पथ के निर्माण के साथ शुरू होता है. विशेष रूप से, प्रकाश स्रोत की पसंद, फिल्टर (टूनाबल और dichroic), फिल्टर स्विचन विधि, और कैमरा उपलब्ध वर्णक्रमी…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को एनएसएफ 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163, और मिशेल कैंसर अनुसंधान से समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं.
Materials
| Airway Smooth Muscle Cells | National Disease Research Interchange (NDRI) | Isolated from human lung tissues obtained from NDRI | Highly autofluorescent, calcium sensitive cells |
| Automated Shutter | Thorlabs Inc. | SHB1 | Remote-controllable shutter to minimize photobleaching |
| Automated Stage | Prior Scientific | H177P1T4 | Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection. |
| Automated Stage Controller (XY) | Prior Scientific | Proscan III (H31XYZE-US) | For interfacing automated stage with computer and joystick |
| Buffer | Made in-house | Made in-house | 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3 |
| Cell Chamber | ThermoFisher Scientific | Attofluor Cell Chamber, A7816 | Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination |
| Excitation Filters | Semrock Inc. | TBP01-378/16 | Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88) |
| Semrock Inc. | TBP01-402/16 | Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8) | |
| Semrock Inc. | TBP01-449/15 | Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8) | |
| Semrock Inc. | TBP01-501/15 | Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84) | |
| Semrock Inc. | TBP01-561/14 | Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83) | |
| Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter | Semrock Inc. | FF495-Di03 | Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78) |
| Fluorescence Filter Cube Longpass Filter | Semrock Inc. | FF01 496/LP-25 | Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86) |
| GCaMP Probe | Addgene | G-CaMP3; Plasmid #22692 | A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator |
| Integrating Sphere | Ocean Optics | FOIS-1 | Used for accurate measurement of wide-angle illumination |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon Instruments | TE2000 | Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue. |
| Mitotracker Green FM | ThermoFisher Scientific | M7514 | Labels mitochondria |
| NIST-Traceable Calibration Lamp | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | A lamp with a known spectrum for use as a standard |
| NIST-Traceable Fluorescein | ThermoFisher Scientific | F36915 | For verifying appropriate spectral response of the system |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | Labels cell nuclei |
| Objective (10X) | Nikon Instruments | Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 | Useful for large fields of view |
| Objective (20X) | Nikon Instruments | Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 | Most often used for tissue samples |
| Objective (60X) | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | Most often used for cell samples |
| sCMOS Camera | Photometrics | Prime 95B (Rev A8-062802018) | For acquiring high-sensitivity digital images |
| Spectrometer | Ocean Optics | QE65000 | Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system |
| Tunable Filter Changer | Sutter Instrument | Lambda VF-5 | Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching |
| Xenon Arc Lamp | Sunoptic Technologies | Titan 300HP Lightsource | Light source with relatively uniform spectral output |
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