التصوير المجهري للتصوير الفائق الطيفي للتصوير الضوئي الفائق الطيفي للتمييز بكفاءة بين إشارات الفلورة

Summary

وقد أصبح التصوير الطيفي حلاً موثوقاً به لتحديد وفصل إشارات الفلورة المتعددة في عينة واحدة، ويمكن أن يميز بسهولة بين الإشارات ذات الأهمية والخلفية أو الفلورة الذاتية. يحسن التصوير الطيفي الفائق المسح الضوئي على هذه التقنية عن طريق تقليل وقت الحصول على الصور اللازمة مع زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء في نفس الوقت.

Abstract

وتعتمد عدة تقنيات على الكشف عن إشارات الفلورة لتحديد الظواهر أو دراستها أو توضيح الوظائف. وقد ثبت أن فصل إشارات الفلورة هذه مرهق حتى ظهور التصوير فوق الطيفي، الذي يمكن فيه فصل مصادر الفلورة عن بعضها البعض وكذلك عن إشارات الخلفية والفلورة الذاتية (نظراً للمعرفة بخصائصها الطيفية التوقيعات). ومع ذلك، فإن التصوير الطيفي الفائق المسحي للانبعاثات التقليدي يعاني من بطء أوقات الاكتساب وانخفاض نسب الإشارة إلى الضوضاء بسبب التصفية الضرورية لكل من الإثارة وضوء الانبعاثات. وقد تبين من قبل أن التصوير الطيفي الفائق المسح يُحدِّد وقت الاكتساب اللازم مع زيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء في البيانات المكتسبة في الوقت نفسه. وباستخدام المعدات المتاحة تجارياً، يصف هذا البروتوكول كيفية تجميع ومعايرة واستخدام نظام تصوير التصوير الطيفي الفائق المسح يُظهر الإثارة لفصل الإشارات عن عدة مصادر فلورسفية في عينة واحدة. في حين أن هذه التقنية تنطبق بشكل كبير على التصوير المجهري للخلايا والأنسجة، إلا أنها قد تكون مفيدة لأي نوع من التجارب التي تستخدم الفلورة التي يمكن فيها تغيير أطوال موجية الإثارة، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر: التصوير الكيميائي، التطبيقات البيئية، ورعاية العيون، وعلوم الأغذية، وعلم الطب الشرعي، والعلوم الطبية، والمعادن.

Introduction

يمكن إجراء التصوير الطيفي بطرق مختلفة ويشار إليه بعدةمصطلحات^1و2و3^و4. وبوجه عام، يشير التصوير الطيفي إلى البيانات التي تم الحصول عليها في بعدين مكانيتين على الأقل وبعد طيفي واحد. يتميز التصوير المتعدد الأطياف وفرط الطيفية في أغلب الأحيان بعدد نطاقات الطول الموجي أو ما إذا كانت النطاقات الطيفية متجاورة¹. وبالنسبة لهذا التطبيق، تُعرَّف البيانات فوق الطيفية بأنها البيانات الطيفية المكتسبة بنطاقات الطول الموجي المتجاورة التي تتحقق عن طريق المباعدة بين الأطوال الموجية المركزية بما لا يقل عن نصف العرض الكامل عند نصف الحد الأقصى (FWHM) لكل مرشح تمرير شريطي يستخدم للإثارة (أي 5 نانومتر تباعد الطول الموجي مركز لمرشحات النطاق مع 14-20 نانومتر عرض النطاق). وتسمح الطبيعة المتجاورة لنطاقات البيانات بالإفراط في أخذ مجموعة البيانات، مما يكفل استيفاء معايير Nyquist عند أخذ عينات من المجال الطيفي.

وقد تم تطوير التصوير فوق الطيفي من قبل ناسا في 1970s و 1980s جنبا إلى جنب مع أول ساتل لاندسات^5,6. وقد أتاح جمع البيانات من عدة نطاقات طيفية متجاورة توليد طيف إشراقة لكل بكسل. إن تحديد وتحديد طيف الإشراقة للمكونات الفردية جعل من الممكن ليس فقط الكشف عن المواد السطحية بواسطة أطيافها المميزة، بل سمح أيضاً بإزالة الإشارات المتداخلة، مثل الاختلافات في الإشارة بسبب الظروف الجوية. وقد طُبق مفهوم الكشف عن المواد باستخدام أطيافها المميزة على النظم البيولوجية في عام 1996 عندما استخدم شروك وآخرون مجموعات من خمسة فلوروفورات مختلفة وأطيافها المعروفة للتمييز بين الكروموسومات المسماة في عملية تسمى [كرّوبي] طيفيّة [كرّووبي]⁷. وقد تم تفصيل هذه التقنية في عام 2000 من قبل Tsurui وآخرون لتصوير الفلورة من عينات الأنسجة، وذلك باستخدام سبعة أصباغ فلورية وتحلل قيمة فريدة لتحقيق الفصل الطيفي لكل بكسل في تركيبات خطية من الأطياف في المرجع مكتبة⁸. وعلى غرار نظيراتها في مجال الاستشعار عن بعد، يمكن حساب مساهمة كل فلوروفور معروف من الصورة الفائقة الطيفية، مع إعطاء معلومات مسبقة عن طيف كل فلوروفور.

كما تم استخدام التصوير الطيفي الفائق في مجالات الزراعة⁹، علم الفلك¹⁰، الطب الحيوي¹¹، التصوير الكيميائي¹²، التطبيقات البيئية¹³، العناية بالعين¹⁴، علوم الأغذية¹⁵، علم الطب الشرعي^16،17، العلوم الطبية¹⁸، علم المعادن¹⁹، والمراقبة^20. ومن القيود الرئيسية لأنظمة التصوير فوق الطيفي المجهر الفلوري الحالي أن تقنية التصوير الطيفي الفائق الطيفي القياسية تعزل إشارات الفلورة في نطاقات ضيقة بنسبة 1) أولاً تصفية ضوء الإثارة للتحكم في الإثارة العينة، ثم 2) مزيد من تصفية الضوء المنبعث لفصل انبعاث الفلورة إلى نطاقات ضيقة التي يمكن فصلها في وقت لاحق رياضيا^21. يؤدي تصفية كل من إضاءة الإثارة والفلورة المنبعثة إلى تقليل مقدار الإشارة المتاحة، مما يقلل من نسبة الإشارة إلى الضوضاء ويتطلب فترات اكتساب طويلة. وتحد الإشارة المنخفضة وفترات الاكتساب الطويلة من إمكانية تطبيق التصوير فوق الطيفي كأداة تشخيصية.

وقد تم تطوير طريقة التصوير التي تستخدم التصوير فوق الطيفي ولكن يعزز الإشارة المتاحة، مما يقلل من وقت الاقتناء اللازم^21،22. وتكتسب هذه الطريقة الجديدة، التي تسمى التصوير الطيفي الفائق المسح للإثارة، بيانات الصورة الطيفية عن طريق تغيير طول موجة الإثارة وجمع مجموعة واسعة من الضوء المنبعث. وقد تبين من قبل أن هذه التقنية تسفر عن أوامر من الزيادات في حجم نسبة الإشارة إلى الضوضاء بالمقارنة مع تقنيات مسح الانبعاثات^21،22. وتعزى الزيادة في نسبة الإشارة إلى الضوضاء إلى حد كبير إلى النطاق الواسع (~ 600 نانومتر) من ضوء الانبعاثات المكتشف، في حين يتم توفير الخصوصية عن طريق تصفية ضوء الإثارة فقط بدلاً من انبعاث الفلورة. وهذا يسمح لجميع الضوء المنبعث (لكل موجة الإثارة) للوصول إلى كاشف^21. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه التقنية للتمييز الفلورة الذاتية من التسميات الخارجية. وعلاوة على ذلك، فإن القدرة على تقليل وقت الاكتساب بسبب زيادة الإشارة القابلة للكشف تقلل من خطر ابيضاض الصور، كما تسمح بإجراء عمليات مسح طيفي بمعدل اكتساب مقبول للتصوير الطيفي بالفيديو.

والهدف من هذا البروتوكول هو أن يكون بمثابة دليل لاقتناء البيانات من أجل التصوير المجهري للتصوير فوق الطيفي المسحي. بالإضافة إلى ذلك، يتم تضمين الأوصاف التي تساعد على فهم مسار الضوء والأجهزة. كما يرد وصف لتنفيذ برمجيات مفتوحة المصدر للمجهر التصويري الفائق الطيفي المسحي. وأخيراً، يتم توفير أوصاف لكيفية معايرة النظام إلى معيار NIST يمكن تتبعها، وضبط إعدادات البرامج والأجهزة للحصول على نتائج دقيقة، وفك خلط الإشارة المكتشفة في مساهمات من مكونات فردية.

Protocol

1. جهاز الإعداد مصدر الضوء: حدد مصدر ضوء طيفي واسع النطاق مع خرج طاقة عالية وترتيب عالي (تم استخدام مصباح قوس يُستخدم بقوة 300 واط في هذه الدراسات). الغالق (اختياري): أضف غالقًا إلى المسار البصري لتقليل ابيضاض الصور للتصوير بالفاصل الزمني. نظام فلتر قابل للضبط: تضمين تجميع ضبط م…

Representative Results

ومن الضروري اتخاذ عدة خطوات هامة من هذا البروتوكول لضمان جمع البيانات الدقيقة والخالية من التصوير والقطع الأثرية الطيفية. وقد يؤدي تخطي هذه الخطوات إلى بيانات تبدو هامة ولكن لا يمكن التحقق منها أو استنساخها مع أي نظام تصوير طيفي آخر، مما يبطل فعلياً أي استنتاجات يتم الت?…

Discussion

يبدأ الاستخدام الأمثل لإعداد التصوير فوق الطيفي المسح يُظهر ببناء مسار الضوء. وعلى وجه الخصوص، فإن اختيار مصدر الضوء، والمرشحات (القابلة للضبط وثنائية الديكروويك)، وطريقة تبديل الفلاتر، والكاميرا تحدد النطاق الطيفي المتاح، وسرعة المسح المحتملة، وحساسية الكاشف، وأخذ العينات المكانية. ت…

Materials

Airway Smooth Muscle Cells	National Disease Research Interchange (NDRI)	Isolated from human lung tissues obtained from NDRI	Highly autofluorescent, calcium sensitive cells
Automated Shutter	Thorlabs Inc.	SHB1	Remote-controllable shutter to minimize photobleaching
Automated Stage	Prior Scientific	H177P1T4	Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.
Automated Stage Controller (XY)	Prior Scientific	Proscan III (H31XYZE-US)	For interfacing automated stage with computer and joystick
Buffer	Made in-house	Made in-house	145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3
Cell Chamber	ThermoFisher Scientific	Attofluor Cell Chamber, A7816	Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination
Excitation Filters	Semrock Inc.	TBP01-378/16	Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)
	Semrock Inc.	TBP01-402/16	Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
	Semrock Inc.	TBP01-449/15	Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
	Semrock Inc.	TBP01-501/15	Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)
	Semrock Inc.	TBP01-561/14	Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)
Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter	Semrock Inc.	FF495-Di03	Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)
Fluorescence Filter Cube Longpass Filter	Semrock Inc.	FF01 496/LP-25	Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)
GCaMP Probe	Addgene	G-CaMP3; Plasmid #22692	A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator
Integrating Sphere	Ocean Optics	FOIS-1	Used for accurate measurement of wide-angle illumination
Inverted Fluorescence Microscope	Nikon Instruments	TE2000	Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.
Mitotracker Green FM	ThermoFisher Scientific	M7514	Labels mitochondria
NIST-Traceable Calibration Lamp	Ocean Optics	LS-1-CAL-INT	A lamp with a known spectrum for use as a standard
NIST-Traceable Fluorescein	ThermoFisher Scientific	F36915	For verifying appropriate spectral response of the system
NucBlue	ThermoFisher Scientific	R37605	Labels cell nuclei
Objective (10X)	Nikon Instruments	Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105	Useful for large fields of view
Objective (20X)	Nikon Instruments	Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205	Most often used for tissue samples
Objective (60X)	Nikon Instruments	Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27	Most often used for cell samples
sCMOS Camera	Photometrics	Prime 95B (Rev A8-062802018)	For acquiring high-sensitivity digital images
Spectrometer	Ocean Optics	QE65000	Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system
Tunable Filter Changer	Sutter Instrument	Lambda VF-5	Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching
Xenon Arc Lamp	Sunoptic Technologies	Titan 300HP Lightsource	Light source with relatively uniform spectral output