Excitation-scanning Hyperspectral Imaging mikroskopi til effektivt at diskriminere fluorescens signaler

Summary

Spectral Imaging er blevet en pålidelig løsning til identifikation og adskillelse af flere fluorescens signaler i en enkelt prøve og kan let skelne signaler af interesse fra baggrund eller autofluorescens. Excitation-scanning hyperspectral Imaging forbedrer denne teknik ved at reducere den nødvendige billed erhvervelse tid samtidig øge signal-til-støj-forholdet.

Abstract

Flere teknikker er afhængige af påvisning af fluorescens signaler for at identificere eller studere fænomener eller for at belyse funktioner. Adskillelse af disse fluorescens signaler blev vist besværligt indtil fremkomsten af hyperspectral Imaging, hvor fluorescens kilder kan adskilles fra hinanden såvel som fra baggrunds signaler og autofluorescens (givet kendskab til deres spektral underskrifter). Men traditionelle, emission-scanning hyperspectral Imaging lider af langsomme anskaffelses tider og lav signal-til-støj nøgletal på grund af den nødvendige filtrering af både excitation og emission lys. Det har tidligere vist sig, at excitation-scanning hyperspectral Imaging reducerer den nødvendige erhvervelse tid samtidig øge signal-til-støj forholdet af erhvervede data. Ved hjælp af kommercielt tilgængeligt udstyr, beskriver denne protokol, hvordan man samler, kalibrerer og bruger et excitation-scanning hyperspectral Imaging mikroskopi system til adskillelse af signaler fra flere fluorescens kilder i en enkelt prøve. Selv om denne teknik er meget anvendelig på mikroskopisk billeddannelse af celler og væv, kan den også være nyttig for enhver form for eksperiment, der udnytter fluorescens, hvor det er muligt at variere excitation bølgelængder, herunder, men ikke begrænset til: kemisk billeddannelse, miljø anvendelser, øjenpleje, levnedsmiddelvidenskab, retsvidenskab, lægevidenskab og mineralogi.

Introduction

Spectral Imaging kan udføres på en række forskellige måder og omtales i flere termer^1,2,3,4. Spektral Imaging refererer generelt til data, som er erhvervet i mindst to rumlige dimensioner og en spektral dimension. Multispektral og hyperspectral billeddannelse udmærker sig oftest ved antallet af bølgelængde bånd, eller om spektral båndene er sammenhængende¹. For denne applikation er hyperspectral data defineret som spektraldata erhvervet med sammenhængende bølgelængde bånd opnået ved mellemrum af Center bølgelængder ikke mindre end halvdelen af fuld bredde på halv maksimum (FWHM) af hver båndpas filter anvendes til excitation (dvs., 5 Nm midterbølge længde afstand for båndpas filtre med 14-20 Nm båndbredder). Den sammenhængende karakter af data båndene giver mulighed for en oversampling af datasæt, at sikre, at Nyquist kriterier er opfyldt, når prøvetagning af spektral domænet.

Hyperspectral Imaging blev udviklet af NASA i 1970 ‘ erne og 1980 ‘ erne i forbindelse med den første landsat satellit^5,6. Indsamling af data fra flere sammenhængende spektralbånd tillod generering af et Radiance spektrum af hver pixel. Identificering og definition af Radiance spektret af individuelle komponenter gjorde det muligt ikke kun at detektere overfladematerialer ved deres karakteristiske spektre, men det tillod også fjernelse af mellemliggende signaler, såsom variationer i signalet på grund af atmosfæriske forhold. Begrebet påvisning af materialer ved hjælp af deres karakteristiske spektre blev anvendt på biologiske systemer i 1996, når Schröck et al. brugte kombinationer af fem forskellige fluorophorer og deres kendte spektre til at skelne mærkede kromosomer i en proces, der betegnes spektral karyotyping⁷. Denne teknik blev uddybet i 2000 af Tsurui et al. for fluorescens billeddannelse af vævsprøver, ved hjælp af syv fluorescerende farvestoffer og ental værdi nedbrydning for at opnå spektral adskillelse af hver pixel i lineære kombinationer af spektre i reference bibliotek⁸. Svarende til deres telemåling modparter, kan bidraget fra hver kendt fluoroforet beregnes fra hyperspectral billede, givet a priori oplysninger om spektret af hver fluoroforet.

Hyperspectral Imaging er også blevet anvendt i områderne landbrug⁹, astronomi¹⁰, biomedicin¹¹, kemisk billeddannelse¹², miljø anvendelser¹³, Eye Care¹⁴, levnedsmiddelvidenskab¹⁵, retsvidenskab^16,17, medicinsk videnskab¹⁸, mineralogi¹⁹, og overvågning²⁰. En vigtig begrænsning af nuværende fluorescens mikroskop hyperspectral Imaging systemer er, at standard hyperspectral imaging teknologi isolerer fluorescens signaler i smalle bånd ved 1) første filtrering af excitation lys til kontrolprøve excitation, så 2) yderligere filtrering udledt lys til at adskille fluorescens emission i smalle bånd, der senere kan adskilles matematisk²¹. Filtrering af både excitation-belysningen og den udsendte fluorescens reducerer mængden af tilgængeligt signal, hvilket sænker signal-til-støj-forholdet og nødvendiggør lange anskaffelses tider. Det lave signal og de lange anskaffelses tider begrænser anvendeligheden af hyperspectral Imaging som et diagnostisk værktøj.

En Imaging modalitet er blevet udviklet, der gør brug af hyperspectral Imaging, men øger det tilgængelige signal, og dermed reducere den nødvendige erhvervelse tid^21,22. Denne nye modalitet, kaldet excitation-scanning hyperspectral Imaging, erhverver spektral billeddata ved at variere excitation bølgelængde og indsamle en bred vifte af udsendte lys. Det har tidligere vist sig, at denne teknik giver størrelses stigninger i signal-støj-forhold i forhold til emissions scanningsteknikker^21,22. Stigningen i signal-støj-forhold skyldes i høj grad den brede båndpas (~ 600 nm) af emissions lyset detekteret, mens specificitet er tilvejebragt ved at filtrere kun excitation lys i stedet for fluorescens emission. Dette gør det muligt for alle udsendte lys (for hver excitation bølgelængde) at nå sensoren²¹. Derudover kan denne teknik bruges til at diskriminere autofluorescens fra udefrakommende etiketter. Desuden reducerer evnen til at reducere anskaffelsestid på grund af øget detekterbart signal faren for foto blegning samt tillader spektral scanninger ved en erhvervelse sats, der er acceptabelt for spektral video Imaging.

Målet med denne protokol er at tjene som en dataindsamling guide til excitation-scanning hyperspectral Imaging mikroskopi. Desuden er beskrivelser inkluderet, der hjælper med at forstå den lette vej og hardware. Også beskrevet er gennemførelsen af open source-software til en excitation-scanning hyperspectral Imaging mikroskop. Endelig, beskrivelser er fastsat for, hvordan du kalibrere systemet til en NIST-sporbare standard, justere software og hardwareindstillinger for nøjagtige resultater, og unmix det detekterede signal til bidrag fra individuelle komponenter.

Protocol

1. opsætning af enhed Lyskilde: Vælg en bredbånds-spektral lyskilde med høj effekt og høj kollimation (en 300 W XE Arc-lampe blev brugt til disse studier). Lukker (valgfrit): Tilføj en udløser til den optiske sti for at reducere foto blegning for tidsforskudt billeddannelse. Tunable filter system: indarbejde en mekanisk tuning samling og tynd-film tunable filter (TFTF) indstillet til at aktivere den ønskede bølgelængde-justerbar excitation rækkevidde (f. eks 360-485 nm). <li…

Representative Results

Flere vigtige skridt fra denne protokol er nødvendige for at sikre indsamlingen af data, der er både nøjagtige og blottet for billeddannelse og spektral artefakter. Hvis du springer disse trin over, kan det resultere i data, der ser betydningsfulde ud, men som ikke kan verificeres eller gengives med andre spektral billedbehandlingssystemer, hvilket effektivt ophæver eventuelle konklusioner, der er foretaget med de pågældende data. Chief blandt disse vigtige trin er korrekt spektral …

Discussion

Den optimale anvendelse af en excitation-scanning hyperspectral Imaging set-up begynder med opførelsen af lysbanen. Især valg af lyskilde, filtre (tunable og dichroic), filter switching metode og kamera bestemme det tilgængelige spektralområde, eventuel scanningshastighed, detektorfølsomhed, og rumlig prøvetagning. Mercury Arc lamper tilbyder mange excitation bølgelængde toppe, men ikke giver en flad spektral udgang og vil kræve betydelige signal reduktion på output toppe at korrigere spektral billeddata tilbag…

Materials

Airway Smooth Muscle Cells	National Disease Research Interchange (NDRI)	Isolated from human lung tissues obtained from NDRI	Highly autofluorescent, calcium sensitive cells
Automated Shutter	Thorlabs Inc.	SHB1	Remote-controllable shutter to minimize photobleaching
Automated Stage	Prior Scientific	H177P1T4	Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.
Automated Stage Controller (XY)	Prior Scientific	Proscan III (H31XYZE-US)	For interfacing automated stage with computer and joystick
Buffer	Made in-house	Made in-house	145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3
Cell Chamber	ThermoFisher Scientific	Attofluor Cell Chamber, A7816	Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination
Excitation Filters	Semrock Inc.	TBP01-378/16	Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)
	Semrock Inc.	TBP01-402/16	Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
	Semrock Inc.	TBP01-449/15	Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
	Semrock Inc.	TBP01-501/15	Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)
	Semrock Inc.	TBP01-561/14	Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)
Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter	Semrock Inc.	FF495-Di03	Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)
Fluorescence Filter Cube Longpass Filter	Semrock Inc.	FF01 496/LP-25	Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)
GCaMP Probe	Addgene	G-CaMP3; Plasmid #22692	A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator
Integrating Sphere	Ocean Optics	FOIS-1	Used for accurate measurement of wide-angle illumination
Inverted Fluorescence Microscope	Nikon Instruments	TE2000	Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.
Mitotracker Green FM	ThermoFisher Scientific	M7514	Labels mitochondria
NIST-Traceable Calibration Lamp	Ocean Optics	LS-1-CAL-INT	A lamp with a known spectrum for use as a standard
NIST-Traceable Fluorescein	ThermoFisher Scientific	F36915	For verifying appropriate spectral response of the system
NucBlue	ThermoFisher Scientific	R37605	Labels cell nuclei
Objective (10X)	Nikon Instruments	Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105	Useful for large fields of view
Objective (20X)	Nikon Instruments	Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205	Most often used for tissue samples
Objective (60X)	Nikon Instruments	Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27	Most often used for cell samples
sCMOS Camera	Photometrics	Prime 95B (Rev A8-062802018)	For acquiring high-sensitivity digital images
Spectrometer	Ocean Optics	QE65000	Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system
Tunable Filter Changer	Sutter Instrument	Lambda VF-5	Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching
Xenon Arc Lamp	Sunoptic Technologies	Titan 300HP Lightsource	Light source with relatively uniform spectral output