Excitation-Scanning Hyperspektrale Bildgebungsmikroskopie zur effizienten Unterscheidung von Fluoreszenzsignalen
Summary
Spektrale Bildgebung hat sich zu einer zuverlässigen Lösung für die Identifizierung und Trennung mehrerer Fluoreszenzsignale in einer einzigen Probe und kann Signale von Interesse leicht von Hintergrund- oder Autofluoreszenz unterscheiden. Die hyperspektrale Bildgebung beim Erregungsscannen verbessert diese Technik, indem die erforderliche Bildaufnahmezeit verringert und gleichzeitig das Signal-Rausch-Verhältnis erhöht wird.
Abstract
Mehrere Techniken basieren auf dem Nachweis von Fluoreszenzsignalen, um Phänomene zu identifizieren oder zu untersuchen oder Funktionen aufzuklären. Die Trennung dieser Fluoreszenzsignale erwies sich bis zum Aufkommen der hyperspektralen Bildgebung als umständlich, bei der Fluoreszenzquellen voneinander sowie von Hintergrundsignalen und Autofluoreszenz getrennt werden können (angesichts der Kenntnis ihrer spektralen Unterschriften). Die traditionelle hyperspektrale Bildgebung beim Emissionsscannen leidet jedoch unter langsamen Erfassungszeiten und niedrigen Signal-Rausch-Verhältnissen aufgrund der notwendigen Filterung sowohl von Anregungs- als auch von Emissionslicht. Es wurde bereits gezeigt, dass die hyperspektrale Bildgebung beim Anregungsscannen die erforderliche Erfassungszeit reduziert und gleichzeitig das Signal-Rausch-Verhältnis der erfassten Daten erhöht. Mit kommerziell erhältlichen Geräten beschreibt dieses Protokoll, wie ein hyperspektrales Mikroskopkopiesystem für die Anregung, das Scannen von Hyperspektralbildern zusammenbaut, kalibriert und verwendet wird, um Signale von mehreren Fluoreszenzquellen in einer einzigen Probe zu trennen. Obwohl diese Technik für die mikroskopische Bildgebung von Zellen und Geweben sehr anwendbar ist, kann sie auch für jede Art von Experiment mit Fluoreszenz nützlich sein, bei dem es möglich ist, Anregungswellenlängen zu variieren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf: chemische Bildgebung, Umweltanwendungen, Augenpflege, Lebensmittelwissenschaft, Forensik, Medizin und Mineralogie.
Introduction
Spektrale Bildgebung kann auf verschiedene Weise durchgeführt werden und wird durch mehrere Begriffe1,2,3,4bezeichnet. Im Allgemeinen bezieht sich die Spektralbildgebung auf Daten, die in mindestens zwei räumlichen Dimensionen und einer Spektraldimension erfasst wurden. Multispektrale und hyperspektrale Bildgebung unterscheiden sich am häufigsten durch die Anzahl der Wellenlängenbänder oder ob die Spektralbänder zusammenhängend sind1. Für diese Anwendung werden hyperspektrale Daten definiert als Spektraldaten, die mit zusammenhängenden Wellenlängenbändern erfasst werden, die durch den Abstand der mittleren Wellenlängen erreicht werden, nicht weniger als die Hälfte der vollen Breite bei halbmaximaler Breite (FWHM) jedes Bandpassfilters, der für die Anregung verwendet wird (d. h. 5 nm Wellenlängenabstand für Bandpassfilter mit 14-20 nm Bandbreiten). Die Kontinuität der Datenbänder ermöglicht ein Oversampling des Datensatzes, wodurch sichergestellt wird, dass die Nyquist-Kriterien beim Sampling der Spektraldomäne erfüllt sind.
Hyperspektrale Bildgebung wurde von der NASA in den 1970er und 1980er Jahren in Verbindung mit dem ersten Landsat-Satelliten5,6entwickelt. Das Sammeln von Daten aus mehreren zusammenhängenden Spektralbändern ermöglichte die Erzeugung eines Strahlungsspektrums jedes Pixels. Die Identifizierung und Definition des Strahlungsspektrums einzelner Komponenten ermöglichte es, Oberflächenmaterialien nicht nur anhand ihrer charakteristischen Spektren zu erkennen, sondern auch intervenierende Signale, wie z.B. Schwankungen des Signals durch atmosphärischen Bedingungen. Das Konzept der Detektion von Materialien anhand ihrer charakteristischen Spektren wurde 1996 auf biologische Systeme angewandt, als Schröck et al. Kombinationen von fünf verschiedenen Fluorophoren und ihren bekannten Spektren verwendeten, um markierte Chromosomen in einem Prozess zu unterscheiden, der als spektrale Karyotypisierung7. Diese Technik wurde im Jahr 2000 von Tsurui et al. für die Fluoreszenzbildgebung von Gewebeproben ausgearbeitet, wobei sieben fluoreszierende Farbstoffe und Singularwertzersetzung verwendet wurden, um eine spektrale Trennung jedes Pixels in lineare Kombinationen von Spektren in der Referenzzuteilung zu erreichen. Bibliothek8. Ähnlich wie ihre Fernerkundungs-Gegenstücke kann der Beitrag jedes bekannten Fluorophors aus dem hyperspektralen Bild berechnet werden, wobei a priori Informationen über das Spektrum jedes Fluorophors gegeben sind.
Hyperspektrale Bildgebung wurde auch in den Bereichen Landwirtschaft9, Astronomie10, Biomedizin11, chemische Bildgebung12, Umweltanwendungen13, Augenpflege14, Lebensmittelwissenschaft15, Forensische Wissenschaft16,17, medizinische Wissenschaft18, Mineralogie19, und Überwachung20. Eine wesentliche Einschränkung der aktuellen hyperspektralen Bildgebungssysteme des Fluoreszenzmikroskops besteht darin, dass die standardmäßige hyperspektrale Bildgebungstechnologie Fluoreszenzsignale in schmalen Bändern isoliert, indem sie zuerst das Anregungslicht filtert, um die Anregung der Probe zu steuern, 2) weitere Filterung emittiertes Licht, um die Fluoreszenzemission in schmale Bänder zu trennen, die später mathematisch getrennt werden können21. Durch das Filtern sowohl der Anregungsbeleuchtung als auch der emittierten Fluoreszenz wird die Menge des verfügbaren Signals reduziert, was das Signal-Rausch-Verhältnis senkt und lange Erfassungszeiten erfordert. Das niedrige Signal und die langen Erfassungszeiten begrenzen die Anwendbarkeit der hyperspektralen Bildgebung als Diagnostisches Werkzeug.
Es wurde eine bildgebende Modalität entwickelt, die hyperspektrale Bildgebung nutzt, aber das verfügbare Signal steigert und dadurch die erforderliche Erfassungszeit21,22reduziert. Diese neue Modalität, die hyperspektrale Bildgebung beim Anregungsscannen genannt wird, erfasst spektrale Bilddaten, indem sie die Anregungswellenlänge variiert und ein breites Spektrum emittierten Lichts sammelt. Es wurde bereits gezeigt, dass diese Technik im Vergleich zu Emissionsscantechniken21,22Größenordnungen im Signal-Rausch-Verhältnis erhöht. Die Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses ist weitgehend auf den weiträumigen (ca. 600 nm) von Emissionslicht, der erkannt wird, während spezifität durch Filterung nur des Anregungslichts anstelle der Fluoreszenzemission gewährleistet wird. Dadurch erreicht das gesamte emittierte Licht (für jede Anregungswellenlänge) den Detektor21. Darüber hinaus kann diese Technik verwendet werden, um Autofluoreszenz von exogenen Etiketten zu unterscheiden. Darüber hinaus reduziert die Möglichkeit, die Erfassungszeit durch erhöhtes nachweisbares Signal zu reduzieren, die Gefahr von Photobleichungen und ermöglicht Spektralscans mit einer Erfassungsrate, die für die spektrale Video-Bildgebung akzeptabel ist.
Ziel dieses Protokolls ist es, als Datenerfassungsleitfaden für die anregend-scannende hyperspektrale Bildgebungsmikroskopie zu dienen. Darüber hinaus sind Beschreibungen enthalten, die helfen, den Lichtpfad und die Hardware zu verstehen. Ebenfalls beschrieben ist die Implementierung von Open-Source-Software für ein anregendes hyperspektrales Bildgebungsmikroskop. Schließlich werden Beschreibungen bereitgestellt, wie das System auf einen NIST-nachverfolgbaren Standard kalibriert, Software- und Hardwareeinstellungen für genaue Ergebnisse angepasst und das erkannte Signal in Beiträge einzelner Komponenten entgemischt werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die optimale Nutzung einer hyperspektralen Bildgebung scannt mit der Konstruktion des Lichtweges. Insbesondere die Wahl der Lichtquelle, Filter (tunable und dichroic), Filter-Switching-Methode und Kamera bestimmen den verfügbaren Spektralbereich, mögliche Scangeschwindigkeit, Detektorempfindlichkeit und räumliche Probenahme. Quecksilberlichtbogenlampen bieten viele Anregungswellenlängenspitzen, bieten jedoch keinen flachen Spektralausgang und erfordern eine signifikante Signalreduktion an den Ausgangsspitzen, um die …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten die Unterstützung von NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE34060163 und dem Abraham Mitchell Cancer Research Fund würdigen.
Materials
| Airway Smooth Muscle Cells | National Disease Research Interchange (NDRI) | Isolated from human lung tissues obtained from NDRI | Highly autofluorescent, calcium sensitive cells |
| Automated Shutter | Thorlabs Inc. | SHB1 | Remote-controllable shutter to minimize photobleaching |
| Automated Stage | Prior Scientific | H177P1T4 | Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection. |
| Automated Stage Controller (XY) | Prior Scientific | Proscan III (H31XYZE-US) | For interfacing automated stage with computer and joystick |
| Buffer | Made in-house | Made in-house | 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3 |
| Cell Chamber | ThermoFisher Scientific | Attofluor Cell Chamber, A7816 | Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination |
| Excitation Filters | Semrock Inc. | TBP01-378/16 | Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88) |
| Semrock Inc. | TBP01-402/16 | Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8) | |
| Semrock Inc. | TBP01-449/15 | Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8) | |
| Semrock Inc. | TBP01-501/15 | Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84) | |
| Semrock Inc. | TBP01-561/14 | Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83) | |
| Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter | Semrock Inc. | FF495-Di03 | Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78) |
| Fluorescence Filter Cube Longpass Filter | Semrock Inc. | FF01 496/LP-25 | Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86) |
| GCaMP Probe | Addgene | G-CaMP3; Plasmid #22692 | A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator |
| Integrating Sphere | Ocean Optics | FOIS-1 | Used for accurate measurement of wide-angle illumination |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon Instruments | TE2000 | Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue. |
| Mitotracker Green FM | ThermoFisher Scientific | M7514 | Labels mitochondria |
| NIST-Traceable Calibration Lamp | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | A lamp with a known spectrum for use as a standard |
| NIST-Traceable Fluorescein | ThermoFisher Scientific | F36915 | For verifying appropriate spectral response of the system |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | Labels cell nuclei |
| Objective (10X) | Nikon Instruments | Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 | Useful for large fields of view |
| Objective (20X) | Nikon Instruments | Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 | Most often used for tissue samples |
| Objective (60X) | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | Most often used for cell samples |
| sCMOS Camera | Photometrics | Prime 95B (Rev A8-062802018) | For acquiring high-sensitivity digital images |
| Spectrometer | Ocean Optics | QE65000 | Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system |
| Tunable Filter Changer | Sutter Instrument | Lambda VF-5 | Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching |
| Xenon Arc Lamp | Sunoptic Technologies | Titan 300HP Lightsource | Light source with relatively uniform spectral output |
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