형광 신호를 효율적으로 구별하기 위한 여기-스캐닝 하이퍼스펙트럼 이미징 현미경 검사법

Summary

스펙트럼 이미징은 단일 샘플에서 여러 형광 신호를 식별하고 분리하는 신뢰할 수 있는 솔루션이 되었으며 관심 있는 신호를 배경 또는 자동 형광과 쉽게 구분할 수 있습니다. 여기 스캐닝 하이퍼스펙트럼 이미징은 필요한 이미지 수집 시간을 줄이면서 동시에 신호 대 잡음 비를 증가시킴으로써 이 기술을 향상시킵니다.

Abstract

몇몇 기술은 현상을 확인하거나 연구하거나 기능을 해명하기 위하여 형광 신호의 탐지에 의존합니다. 이러한 형광 신호의 분리는 형광 원이 배경 신호 및 자가 형광 (스펙트럼에 대한 지식을 감안할 때)뿐만 아니라 서로 분리 될 수있는 하이퍼 스펙트럼 이미징의 출현까지 성가신 것으로 입증되었습니다. 서명)을 참조하십시오. 그러나 기존의 방출 스캐닝 하이퍼스펙트럼 이미징은 여기및 방출 광을 필터링하는 데 필요한 필터링으로 인해 수집 시간이 느리고 신호 대 잡음 비가 낮습니다. 이전에는 여기-스캐닝 하이퍼스펙트럼 이미징이 필요한 수집 시간을 줄이는 동시에 획득된 데이터의 신호 대 잡음 비를 증가시키는 것으로 나타났습니다. 상용 장비를 사용하는 이 프로토콜은 단일 샘플에서 여러 형광원으로부터 신호를 분리하기 위해 여기 스캐닝 하이퍼스펙트럼 이미징 현미경 시스템을 조립, 교정 및 사용하는 방법을 설명합니다. 세포와 조직의 현미경 이미징에 매우 적합하지만, 이 기술은 화학 적 이미징, 환경 응용 프로그램, 안과 치료, 식품 과학, 법의학, 의학 및 광물학.

Introduction

스펙트럼 이미징은 다양한 방법으로 수행될 수 있으며^여러용어1, 2,^3,4에의해 지칭된다. 일반적으로 스펙트럼 이미징은 적어도 2개의 공간 치수와 하나의 스펙트럼 차원에서 수집된 데이터를 말합니다. 다중 스펙트럼 및 하이퍼 스펙트럼 이미징은 파장 대역의 수 또는 스펙트럼 밴드가 연속적인지 여부에 따라 가장 자주 구별됩니다 1. 이 어플리케이션의 경우, 하이퍼스펙트럼 데이터는 여기(즉, 5nm)에 사용되는 각 대역통과 필터의 절반 이하의 전체 폭의 절반 이하의 중앙 파장의 간격으로 달성된 연속 파장 대역으로 획득한 스펙트럼 데이터로 정의됩니다. 14-20 nm 대역폭의 밴드패스 필터의 중심 파장 간격). 데이터 대역의 연속적인 특성을 통해 데이터 집합의 오버샘플링을 허용하므로 스펙트럼 도메인을 샘플링할 때 나이퀴스트 기준이 충족됩니다.

하이퍼 스펙트럼 이미징은 첫 번째 위성 위성과 함께 1970 년대와 1980년대에 NASA에 의해 개발되었다 5,⁶. 여러 연속 스펙트럼 대역에서 데이터를 수집하여 각 픽셀의 복사 스펙트럼을 생성할 수 있었습니다. 개별 부품의 광도 스펙트럼을 식별하고 정의함으로써 특성 스펙트럼에 의한 표면 물질을 감지할 수 있었지만, 이로 인해 신호의 변동과 같은 중간 신호의 제거도 가능해졌습니다. 대기 조건. 1996년 슈뢰크 등은 5개의 다른 형광단과 그 알려진 스펙트럼의 조합을 사용하여 표지된 염색체를 구별하기 위해 그들의 특성 스펙트럼을 사용하여 물질을 검출하는 개념을 생물학적 시스템에 적용했습니다. 스펙트럼 카요티핑⁷. 이 기술은 2000년에 Tsurui 등에서 조직 샘플의 형광 이미징을 위해 7개의 형광 염료와 단수 값 분해를 사용하여 각 픽셀을 스펙트럼의 선형 조합으로 참조에서 스펙트럼으로 분리하는 데 사용했습니다. 라이브러리⁸. 원격 감지 대응과 유사하게, 각 공지된 형광포의 기여도는 각 형광포의 스펙트럼에 대한 선행 정보를 감안할 때, 하이퍼스펙트럼 이미지로부터 계산될 수 있다.

Hyperspectral 화상 진찰은 또한 농업9, 천문학^10,생물 의학^11,화학 화상 진찰^12,환경 응용^13,안과^{배려 14,}식품 과학^15, 법의학^16,17,의료 과학^18,광물학^19,감시^20. 현재 형광 현미경 hyperspectral 화상 진찰 시스템의 중요한 한계는 표준 hyperspectral 화상 진찰 기술이 1) 견본 여기를 통제하기 위하여 여기 빛을 첫째로 여과하여 좁은 대역에서 형광 신호를 격리한다는 것입니다, 그 때 2) 나중에 수학적으로 분리 될 수있는 좁은 밴드로 형광 방출을 분리하기 위해 방출 된 빛을 추가로 필터링^21. 여기 조명과 방출형광을 필터링하면 사용 가능한 신호의 양이 줄어들어 신호 대 잡음 비가 낮아지고 수집 시간이 길어질 수 있습니다. 낮은 신호와 긴 수집 시간은 진단 도구로 하이퍼 스펙트럼 이미징의 적용을 제한합니다.

하이퍼스펙트럼 이미징을 사용하지만 사용 가능한 신호를 향상시켜 필요한 수집 시간^21,22를줄이는 이미징 양식이 개발되었습니다. 여기 스캐닝 하이퍼스펙트럼 이미징이라고 불리는 이 새로운 양식은 여기 파장을 변화시키고 광범위한 방출 광을 수집하여 스펙트럼 이미지 데이터를 수집합니다. 이 기술은 방출 스캐닝 기술^21,22에비해 신호 대 잡음 비의 크기 증가를 산출하는 것으로 이전에 나타났다. 신호 대 잡음 비율의 증가는 주로 검출 된 방출 광의 넓은 대역통과 (~ 600 nm)에 기인하며, 특이성은 형광 방출 대신 여기 광만 필터링하여 제공됩니다. 이렇게 하면 모든 방출된 빛(모든 여기 파장)이 검출기^21에도달할 수 있습니다. 추가적으로, 이 기술은 외인성 레이블에서 자기 형광을 구별하기 위하여 이용될 수 있습니다. 또한, 증가된 감지 신호로 인해 획득 시간을 단축하는 기능은 광표백의 위험을 감소시킬 뿐만 아니라 스펙트럼 비디오 이미징에 허용되는 수집 속도로 스펙트럼 스캔을 허용합니다.

이 프로토콜의 목표는 여기 스캐닝 하이퍼 스펙트럼 이미징 현미경 검사법에 대한 데이터 수집 가이드역할을 하는 것입니다. 또한, 조명 경로 및 하드웨어를 이해하는 데 도움이 설명이 포함되어 있습니다. 또한 여기 스캐닝 하이퍼 스펙트럼 이미징 현미경을 위한 오픈 소스 소프트웨어의 구현에 대해서도 설명합니다. 마지막으로, NIST 추적 가능한 표준으로 시스템을 교정하고, 정확한 결과를 위해 소프트웨어 및 하드웨어 설정을 조정하고, 감지된 신호를 개별 구성 요소의 기여로 혼합해제하는 방법에 대한 설명이 제공됩니다.

Protocol

1. 장치 설정 광원: 높은 출력과 높은 충돌(이러한 연구에 300W Xe 아크 램프가 사용)을 가진 광대역 스펙트럼 광원을 선택합니다. 셔터(선택 사항): 광학 경로에 셔터를 추가하여 시간 경과 이미징을 위해 광표백을 줄입니다. 튜닝 가능한 필터 시스템: 원하는 파장 조절 가능한 여기 범위(예: 360-485 nm)를 가능하게 하는 기계적 튜닝 어셈블리 및 박막 튜닝 필터(TFTF) 세트를 통합합…

Representative Results

이 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계는 정확하고 이미징 및 스펙트럼 아티팩트가 없는 데이터의 수집을 보장하는 데 필요합니다. 이러한 단계를 건너뛰면 중요한 것처럼 보이지만 다른 스펙트럼 이미징 시스템으로 는 확인하거나 재현할 수 없는 데이터가 생성되어 해당 데이터로 이루어진 결론을 효과적으로 무효화할 수 있습니다. 이러한 중요한 단계 중 가장 중요한 단?…

Discussion

여기-스캐닝 하이퍼스펙트럼 이미징 셋업의 최적 사용은 광경로의 구성에서 시작됩니다. 특히 광원, 필터(튜닝 및 이색), 필터 스위칭 방법 및 카메라의 선택은 사용 가능한 스펙트럼 범위, 가능한 스캔 속도, 검출기 감도 및 공간 샘플링을 결정합니다. 머큐리 아크 램프는 많은 여기 파장 피크를 제공하지만 평평한 스펙트럼 출력을 제공하지 않으며 NIST 추적 가능한 응답(38)으로 스펙트럼 이미지<s…

Materials

Airway Smooth Muscle Cells	National Disease Research Interchange (NDRI)	Isolated from human lung tissues obtained from NDRI	Highly autofluorescent, calcium sensitive cells
Automated Shutter	Thorlabs Inc.	SHB1	Remote-controllable shutter to minimize photobleaching
Automated Stage	Prior Scientific	H177P1T4	Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.
Automated Stage Controller (XY)	Prior Scientific	Proscan III (H31XYZE-US)	For interfacing automated stage with computer and joystick
Buffer	Made in-house	Made in-house	145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3
Cell Chamber	ThermoFisher Scientific	Attofluor Cell Chamber, A7816	Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination
Excitation Filters	Semrock Inc.	TBP01-378/16	Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)
	Semrock Inc.	TBP01-402/16	Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
	Semrock Inc.	TBP01-449/15	Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
	Semrock Inc.	TBP01-501/15	Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)
	Semrock Inc.	TBP01-561/14	Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)
Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter	Semrock Inc.	FF495-Di03	Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)
Fluorescence Filter Cube Longpass Filter	Semrock Inc.	FF01 496/LP-25	Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)
GCaMP Probe	Addgene	G-CaMP3; Plasmid #22692	A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator
Integrating Sphere	Ocean Optics	FOIS-1	Used for accurate measurement of wide-angle illumination
Inverted Fluorescence Microscope	Nikon Instruments	TE2000	Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.
Mitotracker Green FM	ThermoFisher Scientific	M7514	Labels mitochondria
NIST-Traceable Calibration Lamp	Ocean Optics	LS-1-CAL-INT	A lamp with a known spectrum for use as a standard
NIST-Traceable Fluorescein	ThermoFisher Scientific	F36915	For verifying appropriate spectral response of the system
NucBlue	ThermoFisher Scientific	R37605	Labels cell nuclei
Objective (10X)	Nikon Instruments	Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105	Useful for large fields of view
Objective (20X)	Nikon Instruments	Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205	Most often used for tissue samples
Objective (60X)	Nikon Instruments	Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27	Most often used for cell samples
sCMOS Camera	Photometrics	Prime 95B (Rev A8-062802018)	For acquiring high-sensitivity digital images
Spectrometer	Ocean Optics	QE65000	Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system
Tunable Filter Changer	Sutter Instrument	Lambda VF-5	Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching
Xenon Arc Lamp	Sunoptic Technologies	Titan 300HP Lightsource	Light source with relatively uniform spectral output