Eksitasjon-skanning hyperspektral tenkelig mikroskopi å effektivt diskriminere fluorescens signaler

Summary

Spectral Imaging har blitt en pålitelig løsning for identifisering og separasjon av flere fluorescens signaler i en enkelt prøve og kan lett skille signaler av interesse fra bakgrunn eller autofluorescence. Eksitasjon-skanning hyperspektral Imaging forbedrer på denne teknikken ved å redusere den nødvendige bildet oppkjøpet tid samtidig øke signal-til-støy-forhold.

Abstract

Flere teknikker er avhengige av påvisning av fluorescens signaler for å identifisere eller studere fenomener eller belyse funksjoner. Separasjon av disse fluorescens signalene ble påvist tungvint inntil advent av hyperspektral Imaging, der fluorescens kilder kan skilles fra hverandre så vel som fra bakgrunnen signaler og autofluorescence (gitt kjennskap til deres Spectral signaturer). Imidlertid, tradisjonell, utstråling-skanning hyperspektral tenkelig lide fra langsom oppkjøpet timene og lav signal-å-bråk forhold på grunn av det på krevd filterene av begge to eksitasjon og utstråling lyset. Det har tidligere vist at eksitasjon hyperspektral Imaging reduserer nødvendig anskaffelsestid samtidig øke signal-til-støy ratio av ervervet data. Ved hjelp av kommersielt tilgjengelig utstyr, beskriver denne protokollen hvordan å montere, kalibrere, og bruke et eksitasjon-skanning hyperspektral Imaging mikroskopi system for separasjon av signaler fra flere fluorescens kilder i en enkelt prøve. Mens svært aktuelt for mikroskopisk bildebehandling av celler og vev, denne teknikken kan også være nyttig for alle typer eksperiment utnytte fluorescens der det er mulig å variere eksitasjon bølgelengder, inkludert men ikke begrenset til: kjemisk Imaging, miljø applikasjoner, øye pleie, mat vitenskap, rettsmedisinske vitenskap, medisinsk vitenskap, og mineralogi.

Introduction

Spectral Imaging kan utføres på en rekke måter, og er referert til av flere termer^1,2,3,4. Vanligvis refererer Spectral Imaging til data ervervet i minst to romlige dimensjoner og en Spectral dimensjon. Multispectral og hyperspektral bilde er oftest preget av antall bølgelengde bånd eller om Spectral band er sammenhengende¹. For dette programmet er hyperspektral data definert som Spectral data ervervet med sammenhengende bølgelengde band oppnås ved avstand fra sentrum bølgelengder ikke mindre enn halvparten av full bredde ved halv maksimal (FWHM) av hvert båndpassfilter som brukes for eksitasjon (dvs. 5 NM senter bølgelengde avstand for bånd pass filtre med 14-20 NM båndbredder). Sammenhengende natur av data båndene tillater en oversampling av datasettet, slik at Nyquist kriterier er oppfylt når prøvetaking av Spectral domenet.

Hyperspektral Imaging ble utviklet av NASA på 1970-og 1980-tallet i forbindelse med den første Landsat satellitten^5,6. Innsamling av data fra flere sammenhengende Spectral band tillot generering av et utstråling spektrum av hver piksel. Identifisere og definere stråleglans spekteret av individuelle komponenter gjorde det mulig å ikke bare oppdage overflate materialer av deres karakteristiske Spectra, men det også tillatt for fjerning av mellomliggende signaler, for eksempel variasjoner i signalet på grunn av atmosfæriske forhold. Konseptet med å påvise materialer ved hjelp av deres karakteristiske Spectra ble brukt på biologiske systemer i 1996, da Schröck et al. brukte kombinasjoner av fem forskjellige fluorophores og deres kjent Spectra å skille merket kromosomer i en prosess betegnes Spectral karyotyping⁷. Denne teknikken ble utarbeidet på 2000 av Tsurui et al. for fluorescens avbildning av vevsprøver, ved hjelp av syv fluorescerende fargestoffer og en talls verdi nedbryting for å oppnå Spectral separasjon av hver piksel i lineære kombinasjoner av Spectra i referansen bibliotek⁸. I likhet med sine eksterne sensing motstykker, kan bidraget til hver kjente fluoroforen beregnes fra hyperspektral bildet, gitt a priori informasjon av spekteret av hver fluoroforen.

Hyperspektral Imaging har også blitt brukt i områdene landbruk⁹, astronomi¹⁰, biomedisin¹¹, Chemical Imaging¹², miljømessige applikasjoner¹³, Eye Care¹⁴, mat Science¹⁵, Forensic Science^16,17, Medical Science¹⁸, mineralogi¹⁹, og overvåkning²⁰. En nøkkel begrensning av gjeldende fluorescens mikroskop hyperspektral Imaging systemer er at standard hyperspektral Imaging teknologi isolerer fluorescens signaler i trange bånd med 1) først filtrere eksitasjon lys for å kontrollere prøven eksitasjon, deretter 2) ytterligere filtrering slippes lys for å skille fluorescens utslipp til smale band som senere kan skilles matematisk²¹. Filtrering både eksitasjon belysning og slippes fluorescens reduserer mengden tilgjengelig signal, som senker signal-til-støy-forhold og nødvendiggjør lengre oppkjøp ganger. Den lave signal og lange oppkjøpet ganger begrense anvendelsen av hyperspektral Imaging som et diagnostisk verktøy.

En Imaging modalitet er utviklet som gjør bruk av hyperspektral Imaging men øker tilgjengelig signal, og dermed redusere den nødvendige oppkjøpet tid^21,22. Denne nye modalitet, kalt eksitasjon-skanning hyperspektral Imaging, kjøper Spectral bildedata ved å variere eksitasjon bølgelengde og samle et bredt spekter av slippes ut lys. Det har tidligere vist at denne teknikken gir størrelsesordener økninger i signal-til-støy-forhold i forhold til utslipps skanning teknikker^21,22. Økningen i signal-til-støy-forhold er i stor grad på grunn av den brede bånd pass (~ 600 NM) av utslipps lyset oppdaget, mens spesifisitet er gitt ved å filtrere bare eksitasjon lys i stedet for fluorescens utslipp. Dette gjør at alle slippes lys (for hver eksitasjon bølgelengde) for å nå detektoren²¹. I tillegg kan denne teknikken brukes til å diskriminere autofluorescence fra eksogene etiketter. Videre kan evnen til å redusere anskaffelses tiden på grunn av økt synlig signal reduserer faren for photobleaching i tillegg til at Spectral skanner på en anskaffelses hastighet som er akseptabelt for Spectral video Imaging.

Målet med denne protokollen er å tjene som en datainnsamling guide for eksitasjon-skanning hyperspektral Imaging mikroskopi. I tillegg er beskrivelser inkludert som bidrar til å forstå lys banen og maskinvaren. Også beskrevet er gjennomføringen av åpen kildekode-programvare for en eksitasjon-skanning hyperspektral Imaging mikroskop. Til slutt, beskrivelser er gitt for hvordan du skal kalibrere systemet til en NIST-sporbar standard, justere programvare og maskinvare for nøyaktige resultater, og unmix det oppdagede signalet inn bidrag fra enkelte komponenter.

Protocol

1. enhetsoppsett Lyskilde: Velg en bred bånds lys kilde med høy effekt og høy kollimasjon (en 300 W XE lys bue lampe ble brukt til disse studiene). Shutter (valgfritt): Legg til en lukker til den optiske banen for å redusere photobleaching for tidsforløp avbildning. Tunable filter system: innlemme en mekanisk tuning montering og Thin-Film tunable filter (TFTF) satt til å muliggjøre ønsket bølgelengde-justerbar eksitasjon rekkevidde (f. eks, 360-485 NM). Mikroskop: Bruk en …

Representative Results

Flere viktige skritt fra denne protokollen er nødvendig for å sikre innsamling av data som er både nøyaktig og blottet for bildebehandling og Spectral gjenstander. Hvis du hopper over disse trinnene, kan det føre til at data vises betydelig, men ikke kan verifiseres eller reproduseres med andre bildebehandlings systemer, og dermed effektivt oppheve eventuelle konklusjoner gjort med nevnte data. Chief blant disse viktige trinnene er riktig Spectral output korreksjon (del 3). Korrigeri…

Discussion

Den optimale bruken av et hyperspektral bildeoppsett med eksitasjon skanning begynner med byggingen av lys banen. Spesielt valg av lyskilde, filtre (tunable og dichroic), filter veksling metoden, og kameraet bestemme tilgjengelig Spectral Range, mulig skannehastighet, detektor følsomhet, og romlig prøvetaking. Mercury Arc lamper tilbyr mange eksitasjon bølgelengde topper, men gir ikke en flat Spectral output og vil kreve betydelig signal reduksjon ved utgangs toppene for å korrigere Spectral bildedata tilbake til en …

Materials

Airway Smooth Muscle Cells	National Disease Research Interchange (NDRI)	Isolated from human lung tissues obtained from NDRI	Highly autofluorescent, calcium sensitive cells
Automated Shutter	Thorlabs Inc.	SHB1	Remote-controllable shutter to minimize photobleaching
Automated Stage	Prior Scientific	H177P1T4	Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection.
Automated Stage Controller (XY)	Prior Scientific	Proscan III (H31XYZE-US)	For interfacing automated stage with computer and joystick
Buffer	Made in-house	Made in-house	145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3
Cell Chamber	ThermoFisher Scientific	Attofluor Cell Chamber, A7816	Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination
Excitation Filters	Semrock Inc.	TBP01-378/16	Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88)
	Semrock Inc.	TBP01-402/16	Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
	Semrock Inc.	TBP01-449/15	Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8)
	Semrock Inc.	TBP01-501/15	Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84)
	Semrock Inc.	TBP01-561/14	Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83)
Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter	Semrock Inc.	FF495-Di03	Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78)
Fluorescence Filter Cube Longpass Filter	Semrock Inc.	FF01 496/LP-25	Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86)
GCaMP Probe	Addgene	G-CaMP3; Plasmid #22692	A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator
Integrating Sphere	Ocean Optics	FOIS-1	Used for accurate measurement of wide-angle illumination
Inverted Fluorescence Microscope	Nikon Instruments	TE2000	Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue.
Mitotracker Green FM	ThermoFisher Scientific	M7514	Labels mitochondria
NIST-Traceable Calibration Lamp	Ocean Optics	LS-1-CAL-INT	A lamp with a known spectrum for use as a standard
NIST-Traceable Fluorescein	ThermoFisher Scientific	F36915	For verifying appropriate spectral response of the system
NucBlue	ThermoFisher Scientific	R37605	Labels cell nuclei
Objective (10X)	Nikon Instruments	Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105	Useful for large fields of view
Objective (20X)	Nikon Instruments	Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205	Most often used for tissue samples
Objective (60X)	Nikon Instruments	Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27	Most often used for cell samples
sCMOS Camera	Photometrics	Prime 95B (Rev A8-062802018)	For acquiring high-sensitivity digital images
Spectrometer	Ocean Optics	QE65000	Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system
Tunable Filter Changer	Sutter Instrument	Lambda VF-5	Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching
Xenon Arc Lamp	Sunoptic Technologies	Titan 300HP Lightsource	Light source with relatively uniform spectral output