Возбуждение-сканирование гиперспектральной микроскопии изображений для эффективной дискриминации сигналов флуоресценции
Summary
Спектральная визуализация стала надежным решением для идентификации и разделения множественных сигналов флуоресценции в одном образце и может легко отличить сигналы интереса от фона или автофлюоресценции. Экзитс-сканирующая гиперспектральная визуализация улучшает эту технику, уменьшая необходимое время приобретения изображения, одновременно увеличивая соотношение сигнала к шуму.
Abstract
Некоторые методы полагаются на обнаружение сигналов флуоресценции для выявления или изучения явлений или для выяснения функций. Разделение этих сигналов флуоресценции было доказано громоздким до появления гиперспектральной визуализации, в которой источники флуоресценции могут быть отделены друг от друга, а также от фоновых сигналов и автофлуоресценции (с учетом знаний об их спектральной подписей). Тем не менее, традиционные, выбросов сканирования гиперспектральной визуализации страдает от медленного времени приобретения и низкие соотношения сигнала к шуму из-за необходимой фильтрации как возбуждение и выброс света. Ранее было показано, что гиперспектральная визуализация, сканирующая возбуждение, сокращает необходимое время приобретения, одновременно увеличивая соотношение сигнала к шуму приобретенных данных. Используя коммерчески доступное оборудование, этот протокол описывает, как собирать, калибровать и использовать систему микроскопии гиперспектральной визуализации, сканирующую возбуждение, для отделения сигналов от нескольких источников флуоресценции в одном образце. Хотя этот метод очень применим к микроскопической визуализации клеток и тканей, он также может быть полезен для любого типа эксперимента с использованием флуоресценции, в которой можно изменять длины волн возбуждения, включая, но не ограничиваясь: химическую визуализацию, экологических приложений, ухода за глазами, пищевой науки, судебной науки, медицинской науки и минералогии.
Introduction
Спектральная визуализация может быть выполнена различными способамии упоминается несколькими терминами 1,2,3,4. В целом спектральная визуализация относится к данным, полученным по крайней мере в двух пространственных измерениях и одном спектральном измерении. Многоспектральные и гиперспектральные изображения чаще всего различаются по количеству полос длин волн или же спектральные полосы смежные1. Для этого приложения гиперспектральные данные определяются как спектральные данные, полученные с смежными полосами длины волны, достигнутые путем интервала длины центральной волны не менее половины полной ширины на половину максимум (FWHM) каждого фильтра bandpass, используемого для возбуждения (т.е. 5 нм интервал длины центральной волны для фильтров полоспаса с пропускной способностью 14-20 нм). Смежный характер диапазонов данных позволяет перебирать набор данных, гарантируя, что критерии Nyquist удовлетворяются при выборке спектрального домена.
Гиперспектральная визуализация была разработана НАСА в 1970-х и 1980-х годах в сочетании с первым спутником Landsat5,6. Сбор данных из нескольких смежных спектральных полос позволил понять спектр сияния каждого пикселя. Выявление и определение спектра сияния отдельных компонентов позволило не только обнаружить поверхностные материалы по их характерным спектрам, но и позволило удалить промежуточные сигналы, такие как вариации сигнала из-за атмосферных условий. Концепция обнаружения материалов с использованием их характерных спектров была применена к биологическим системам в 1996 году, когда Шрёк и др. использовали комбинации пяти различных фторофоров и их известных спектров, чтобы различать помеченные хромосомы в процессе, называемом спектральный кариотипирование7. Этот метод был разработан в 2000 году Tsurui et al. для флуоресценции изображений образцов тканей, используя семь флуоресцентных красителей и разложение единственного значения для достижения спектрального разделения каждого пикселя на линейные комбинации спектров в справке библиотека8. Подобно их коллегам дистанционного зондирования, вклад каждого известного фторфора может быть рассчитан на основе гиперспектрального изображения, учитывая априори информацию спектра каждого фторофра.
Гиперспектральная визуализация также была использована в областях сельского хозяйства9, астрономия10, биомедицина11, химическая визуализация12, экологические приложения13, уход за глазами14, пищевая наука15, судебно-медицинской экспертизы16,17, медицинской науки18, минералогии19, и наблюдения20. Ключевым ограничением текущего флуоресцентного микроскопа гиперспектральных систем визуализации является то, что стандартная технология гиперспектральной визуализации изолирует сигналы флуоресценции в узких диапазонах на 1) сначала фильтрации возбуждания света для контроля образца возбуждения, то 2) дальнейшая фильтрация излучаемого света, чтобы отделить излучение флуоресценции в узкие полосы, которые позже могут быть отделены математически21. Фильтрация как возбуждения освещения и испускаемых флуоресценции уменьшает количество доступного сигнала, что снижает соотношение сигнала к шуму и требует длительного времени приобретения. Низкий сигнал и длительное время приобретения ограничивают применимость гиперспектральной визуализации в качестве диагностического инструмента.
Была разработана методика визуализации, которая использует гиперспектральную визуализацию, но повышает доступный сигнал, тем самым уменьшая необходимое время приобретения21,22. Эта новая модальность, называемая гиперспектральной визуализацией, сканирующей возбуждающие возбуждение, приобретает спектральные данные изображений, изменяя длину волны возбуждения и собирая широкий спектр излучаемого света. Ранее было показано, что этот метод дает порядки величины увеличивается в сигнал к шуму соотношение по сравнению с методами сканирования выбросов21,22. Увеличение соотношения сигнала к шуму в значительной степени обусловлено широкой полосой (600 нм) обнаруженного светового света, в то время как специфичность обеспечивается путем фильтрации только света возбуждения вместо флуоресценционного излучения. Это позволяет всем излучаемым светом (для каждой длины волны возбуждения) достичь детектора21. Кроме того, этот метод может быть использован для дискриминирования автофлюоресценции от экзогенных меток. Кроме того, способность сократить время приобретения за счет увеличения обнаруживаемого сигнала снижает опасность фотоотбеления, а также позволяет спектрального сканирования со скоростью приобретения, что является приемлемым для спектральной видеосъемки.
Цель этого протокола заключается в том, чтобы служить в качестве руководства по сбору данных для экзит-сканирующей микроскопии гиперспектральной визуализации. Кроме того, включены описания, которые помогают понять световой путь и аппаратное обеспечение. Также описана реализация программного обеспечения с открытым исходным кодом для микроскопа гиперспектральной визуализации, сканирующего возбуждение. Наконец, приводятся описания того, как откалибровать систему в стандарт NIST- traceable, настроить настройки программного и аппаратного обеспечения для точных результатов и не смешивать обнаруженный сигнал в вклады отдельных компонентов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Оптимальное использование гиперспектральной визуализации, сканирующего возбуждение, начинается со построения световой траектории. В частности, выбор источника света, фильтров (невозможных и дихронических), метода переключения фильтров и камеры определяют доступный спектральный диа…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы отметить поддержку со стороны NSF 1725937, NIH P01HL066299, NIH R01HL058506, NIH S10OD020149, NIH UL1 TR001417, NIH R01HL137030, AHA 18PRE3406016.
Materials
| Airway Smooth Muscle Cells | National Disease Research Interchange (NDRI) | Isolated from human lung tissues obtained from NDRI | Highly autofluorescent, calcium sensitive cells |
| Automated Shutter | Thorlabs Inc. | SHB1 | Remote-controllable shutter to minimize photobleaching |
| Automated Stage | Prior Scientific | H177P1T4 | Remote-controllable stage for automated multiple field of view or stitched image collection. |
| Automated Stage Controller (XY) | Prior Scientific | Proscan III (H31XYZE-US) | For interfacing automated stage with computer and joystick |
| Buffer | Made in-house | Made in-house | 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 20 mM HEPES, 10 mM D-glucose, 1 mM MgCl2, and 1mM CaCl2, at pH 7.3 |
| Cell Chamber | ThermoFisher Scientific | Attofluor Cell Chamber, A7816 | Coverslip holder composed of surgical stainless steel and a rubber O-ring to seal in media and prevent sample and/or objective contamination |
| Excitation Filters | Semrock Inc. | TBP01-378/16 | Center wavelength range (340-378 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.88) |
| Semrock Inc. | TBP01-402/16 | Center wavelength range (360-400 nm), Bandwidth (Minimum 16 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8) | |
| Semrock Inc. | TBP01-449/15 | Center wavelength range (400-448.8 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.8) | |
| Semrock Inc. | TBP01-501/15 | Center wavelength range (448.8-501.5 nm), Bandwidth (Minimum 15 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.84) | |
| Semrock Inc. | TBP01-561/14 | Center wavelength range (501.5-561 nm), Bandwidth (Minimum 14 nm, nominal FWHM 20 nm), Refractive index (1.83) | |
| Fluorescence Filter Cube Dichroic Beamsplitter | Semrock Inc. | FF495-Di03 | Separates excitation and emission light at 495 nm (>98% reflection between 350-488 nm, >93% transmission between 502-950 nm), Filter effective index (1.78) |
| Fluorescence Filter Cube Longpass Filter | Semrock Inc. | FF01 496/LP-25 | Allows passage of light longer than 496 nm ( >93% average transmission between 503.2-1100 nm), Refractive index (1.86) |
| GCaMP Probe | Addgene | G-CaMP3; Plasmid #22692 | A single-wavelength GCaMP2-based genetically encoded calcium indicator |
| Integrating Sphere | Ocean Optics | FOIS-1 | Used for accurate measurement of wide-angle illumination |
| Inverted Fluorescence Microscope | Nikon Instruments | TE2000 | Inverted microscopes allow direct excitation of sample without the need to penetrate layers of media and/or tissue. |
| Mitotracker Green FM | ThermoFisher Scientific | M7514 | Labels mitochondria |
| NIST-Traceable Calibration Lamp | Ocean Optics | LS-1-CAL-INT | A lamp with a known spectrum for use as a standard |
| NIST-Traceable Fluorescein | ThermoFisher Scientific | F36915 | For verifying appropriate spectral response of the system |
| NucBlue | ThermoFisher Scientific | R37605 | Labels cell nuclei |
| Objective (10X) | Nikon Instruments | Plan Apo λ 10X/0.45 ∞/0.17 MRD00105 | Useful for large fields of view |
| Objective (20X) | Nikon Instruments | Plan Apo λ 20X/0.75 ∞/0.17 MRD00205 | Most often used for tissue samples |
| Objective (60X) | Nikon Instruments | Plan Apo VC 60X/1.2 WI ∞/0.15-0.18 WD 0.27 | Most often used for cell samples |
| sCMOS Camera | Photometrics | Prime 95B (Rev A8-062802018) | For acquiring high-sensitivity digital images |
| Spectrometer | Ocean Optics | QE65000 | Used to measure spectral output of excitation-scanning spectral system |
| Tunable Filter Changer | Sutter Instrument | Lambda VF-5 | Motorized unit for automated excitation filter tuning/switching |
| Xenon Arc Lamp | Sunoptic Technologies | Titan 300HP Lightsource | Light source with relatively uniform spectral output |
Referências
- Hagen, N. A., Kudenov, M. W. Review of snapshot spectral imaging technologies. Optical Engineering. 52 (9), 90901 (2013).
- Li, Q., He, X., Wang, Y., Liu, H., Xu, D., Guo, F. Review of spectral imaging technology in biomedical engineering: achievements and challenges. Journal of Biomedical Optics. 18 (10), 100901 (2013).
- Lu, G., Fei, B. Medical hyperspectral imaging: a review. Journal of Biomedical Optics. 19 (1), 10901 (2014).
- Mehta, N., Shaik, S., Devireddy, R., Gartia, M. R. Single-Cell Analysis Using Hyperspectral Imaging Modalities. Journal of Biomechanical Engineering. 140 (2), 20802 (2018).
- Goetz, A. F. H. Three decades of hyperspectral remote sensing of the Earth: A personal view. Remote Sensing of Environment. 113, S5-S6 (2009).
- Goetz, A. F. Measuring the Earth from Above: 30 Years(and Counting) of Hyperspectral Imaging. Photonics Spectra. 45 (6), 42-47 (2011).
- Schröck, E. Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science. 273 (5274), 494-497 (1996).
- Tsurui, H. Seven-color fluorescence imaging of tissue samples based on Fourier spectroscopy and singular value decomposition. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 48 (5), 653-662 (2000).
- Lu, R., Chen, Y. R. Hyperspectral imaging for safety inspection of food and agricultural products. SPIE. 3544, 121-134 (1999).
- Hege, E. K., O’Connell, D., Johnson, W., Basty, S., Dereniak, E. L. Hyperspectral imaging for astronomy and space surviellance. SPIE. 5159, 380-392 (2004).
- Vo-Dinh, T. A hyperspectral imaging system for in vivo optical diagnostics. IEEE Engineering in Medicine and Biology Magazine. 23 (5), 40-49 (2004).
- Dorrepaal, R. M., Gowen, A. A. Identification of Magnesium Oxychloride Cement Biomaterial Heterogeneity using Raman Chemical Mapping and NIR Hyperspectral Chemical Imaging. Scientific Reports. 8 (1), 13034 (2018).
- Swayze, G. A. Using imaging spectroscopy to map acidic mine waste. Environmental Science & Technology. 34 (1), 47-54 (2000).
- Khoobehi, B., Beach, J. M., Kawano, H. Hyperspectral imaging for measurement of oxygen saturation in the optic nerve head. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (5), 1464-1472 (2004).
- Gowen, A., O’Donnell, C., Cullen, P., Downey, G., Frias, J. Hyperspectral imaging-an emerging process analytical tool for food quality and safety control. Trends in Food Science & Technology. 18 (12), 590-598 (2007).
- Edelman, G., van Leeuwen, T. G., Aalders, M. C. Hyperspectral imaging for the age estimation of blood stains at the crime scene. Forensic Science International. 223 (1), 72-77 (2012).
- Edelman, G., Gaston, E., Van Leeuwen, T., Cullen, P., Aalders, M. Hyperspectral imaging for non-contact analysis of forensic traces. Forensic Science International. 223 (1), 28-39 (2012).
- Markgraf, W., Feistel, P., Thiele, C., Malberg, H. Algorithms for mapping kidney tissue oxygenation during normothermic machine perfusion using hyperspectral imaging. Biomedical Engineering/Biomedizinische Technik. 63 (5), 557-566 (2018).
- Boubanga-Tombet, S. Thermal Infrared Hyperspectral Imaging for Mineralogy Mapping of a Mine Face. Remote sensing. 10 (10), 1518 (2018).
- Yuen, P. W., Richardson, M. An introduction to hyperspectral imaging and its application for security, surveillance and target acquisition. The Imaging Science Journal. 58 (5), 241-253 (2010).
- Favreau, P. F. Excitation-scanning hyperspectral imaging microscope. Journal of Biomedical Optics. 19 (4), 046010-046010 (2014).
- Favreau, P. Thin-film tunable filters for hyperspectral fluorescence microscopy. Journal of biomedical optics. 19 (1), 011017-011017 (2014).
- Leavesley, S. J. Hyperspectral imaging microscopy for identification and quantitative analysis of fluorescently-labeled cells in highly autofluorescent tissue. Journal of Biophotonics. 5 (1), 67-84 (2012).
- Annamdevula, N. S. Spectral imaging of FRET-based sensors reveals sustained cAMP gradients in three spatial dimensions. Cytometry Part A. 93 (10), 1029-1038 (2018).
- Deshpande, D. A., Walseth, T. F., Panettieri, R. A., Kannan, M. S. CD38/cyclic ADP-ribose-mediated Ca2+ signaling contributes to airway smooth muscle hyper-responsiveness. The FASEB Journal. 17 (3), 452-454 (2003).
- Deshpande, D. A. Modulation of calcium signaling by interleukin-13 in human airway smooth muscle: role of CD38/cyclic adenosine diphosphate ribose pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 36-42 (2004).
- Guo, M. Cytokines regulate β-2-adrenergic receptor responsiveness in airway smooth muscle via multiple PKA-and EP2 receptor-dependent mechanisms. Bioquímica. 44 (42), 13771-13782 (2005).
- Mansfield, J. R., Gossage, K. W., Hoyt, C. C., Levenson, R. M. Autofluorescence removal, multiplexing, and automated analysis methods for in-vivo fluorescence imaging. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41207 (2005).
- Mansfield, J. R., Hoyt, C., Levenson, R. M. Visualization of microscopy-based spectral imaging data from multi-label tissue sections. Current Protocols in Molecular Biology. 84 (1), 14-19 (2008).
- Bouchard, M. B. Recent advances in catheter-based optical coherence tomography (OCT) have provided the necessary resolution and acquisition speed for high-quality intravascular imaging. Complications associated with clearing blood from the vessel of a living patient have. Journal of Biomedical Optics. 12 (5), 51601 (2007).
- Mansfield, J. R. Distinguished photons: a review of in vivo spectral fluorescence imaging in small animals. Current Pharmaceutical Biotechnology. 11 (6), 628-638 (2010).
- Levenson, R. M., Mansfield, J. R. Multispectral imaging in biology and medicine: slices of life. Cytometry Part A. 69 (8), 748-758 (2006).
- Gammon, S. T., Leevy, W. M., Gross, S., Gokel, G. W., Piwnica-Worms, D. Spectral unmixing of multicolored bioluminescence emitted from heterogeneous biological sources. Analytical Chemistry. 78 (5), 1520-1527 (2006).
- . . Spectral Unmixing Plugins. , (2006).
- . . Spectral Unmixing of Bioluminescence Signals. , (2006).
- Keshava, N., Mustard, J. F. Spectral unmixing. IEEE Signal Processing Magazine. 19 (1), 44-57 (2002).
- Deal, J. Identifying molecular contributors to autofluorescence of neoplastic and normal colon sections using excitation-scanning hyperspectral imaging. Journal of Biomedical Optics. 23 (12), (2018).
- Microscopy Key, . Microscopy: Key Considerations for Nonlaser Light Sources | Features. BioPhotonics. , (2016).
- Chiu, L., Su, L., Reichelt, S., Amos, W. Use of a white light supercontinuum laser for confocal interference-reflection microscopy. Journal of Microscopy. 246 (2), 153-159 (2012).
- . . Choosing the best light source for your fluorescence experiment. , (2019).
- Beier, H. T., Ibey, B. L. Experimental comparison of the high-speed imaging performance of an EM-CCD and sCMOS camera in a dynamic live-cell imaging test case. PLoS ONE. 9 (1), e84614 (2014).
- Tutt, J. Comparison of EM-CCD and scientific CMOS based camera systems for high resolution X-ray imaging and tomography applications. Journal of Instrumentation. 9 (6), P06017 (2014).
- Coates, C. New sCMOS vs. current microscopy cameras. Biophotonics International. 18 (5), 24-27 (2011).
- Neher, R., Neher, E. Optimizing imaging parameters for the separation of multiple labels in a fluorescence image. Journal of Microscopy. 213 (1), 46-62 (2004).
- Deal, J. Hyperspectral imaging fluorescence excitation scanning spectral characteristics of remodeled mouse arteries. SPIE. 10890, 108902M (2019).
- Deal, J., Rich, T. C., Leavesley, S. J. Optimizing channel selection for excitation-scanning hyperspectral imaging. SPIE. , 108811B (2019).
- Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microscopy Research and Technique. 74 (6), 539-545 (2011).
- . . Comparison with other microscopy software – Micro-manager. , (2012).
