Un modelo de ratón no aleatorio para la reactivación farmacológica de Mecp2 en el cromosoma X inactivo
Summary
Aquí describimos un protocolo para generar un modelo murino femenino viable con inactivación cromosómica no aleatoria, es decir, el cromosoma X de herencia maternalmente está inactivo en el 100% de las células. También describimos un protocolo para probar la viabilidad, la tolerabilidad y la seguridad de la reactivación farmacológica del cromosoma X inactivo in vivo.
Abstract
La inactivación del cromosoma x (XCI) es el silenciamiento aleatorio de un cromosoma X en las hembras para lograr el equilibrio de dosis genéticas entre los sexos. Como resultado, todas las hembras son heterocigósas para la expresión génica ligada al X. Uno de los reguladores clave de XCI es Xist, que es esencial para el inicio y mantenimiento de XCI. Estudios previos han identificado 13 factores de inactivación cromosómica de acción trans (XCIFs) que utilizan una pantalla genética de pérdida de función a gran escala. La inhibición de XCIFs, como ACVR1 y PDPK1, mediante el uso de ARN de horquilla corta o de inhibidores de moléculas pequeñas, reactiva los genes relacionados con los cromosomas X en las células cultivadas. Pero la viabilidad y tolerabilidad de reactivar el cromosoma X inactivo in vivo queda por determinar. Hacia este objetivo, se ha generado un modelo de ratón Xistδ: MECP2/Xist: MECP2-GFP con XCI no aleatorio debido a la eliminación de Xist en un cromosoma X. Usando este modelo, la extensión de la reactivación X inactiva fue cuantitada en el cerebro del ratón después del tratamiento con inhibidores de XCIF. Los resultados publicados recientemente muestran, por primera vez, que la inhibición farmacológica de XCIFs reactiva el Mecp2 del cromosoma X inactivo en las neuronas corticales del cerebro viviente del ratón.
Introduction
La inactivación del cromosoma x (XCI) es un proceso de compensación de dosis que equilibra la expresión génica ligada al X mediante el silenciamiento de una copia del cromosoma X en las hembras1. Como resultado, el cromosoma X inactivo (XI) acumula rasgos característicos de la heterocromatina, incluyendo la metilación del ADN y las modificaciones de la histona inhibitoria, tales como histona H3-lisina 27 trimetilación (H3K27me3) e histona H2A ubiquitinación (H2Aub) 2. el regulador maestro del silenciamiento cromosómico x es la región centro de inactivación x (XIC), alrededor de 100-500 KB, que controla el conteo y emparejamiento de los cromosomas x, la elección aleatoria del cromosoma x para la inactivación, y la iniciación y propagación del silenciamiento a lo largo del cromosoma X3. El proceso de inactivación X se inicia mediante una transcripción específica X inactiva (Xist) que recubre el XI en CIS para mediar el silenciamiento de todo el cromosoma y la remodelación de la estructura tridimensional del cromosoma X4. Recientemente, varias pantallas proteómicas y genéticas han identificado reguladores adicionales de XCI, como las proteínas de interacción Xist 5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. por ejemplo, un estudio anterior que utiliza una pantalla de interferencia de ARN no sesgada de todo el genoma identificó 13 factores de XCI de acción Trans(xcifs)12. Mecaniísticamente, XCIFs regula la expresión Xist y, por lo tanto, interferir con la función xcifs causa XCI12defectuoso. En conjunto, los avances recientes en el campo han proporcionado información importante sobre la maquinaria molecular necesaria para iniciar y mantener la XCI.
La identificación de los reguladores de XCI y la comprensión de su mecanismo en XCI es directamente relevante para las enfermedades humanas vinculadas a X, como el síndrome de rett (RTT)13,14. El RTT es un trastorno raro del desarrollo neurológico causado por una mutación heterocigosa en la proteína de unión al metil-CpG 2 ligada al X (MECP2) que afecta predominantemente a las niñas15. Debido a que el MECP2 se encuentra en el cromosoma X, las niñas RTT son heterocigosas para la deficiencia de MECP2 con ~ 50% de células que expresan el tipo salvaje y ~ 50% expresan un mutante MECP2. En particular, las células mutantes RTT albergan una copia inactiva pero de tipo salvaje de Mecp2 en el XI, proporcionando una fuente del gen funcional, que si se reactiva, podría aliviar los síntomas de la enfermedad. Además del RTT, hay varias otras enfermedades humanas vinculadas al X, para las que la reactivación de XI representa un posible enfoque terapéutico, como el síndrome de DDX3X.
La inhibición de XCIFs, proteína de 3-fosfoinositida dependiente quinasa-1 (PDPK1), y Activin un receptor tipo 1 (ACVR1), ya sea por el ARN corto del pelo (shRNA) o inhibidores de moléculas pequeñas, reactiva los genes XI-vinculados12. La reactivación farmacológica de genes XI-ligados se observa en varios modelos ex vivo que incluyen líneas celulares de fibroblastos de ratón, neuronas corticales de ratones adultos, fibroblastos embrionarios de ratón y líneas celulares de fibroblastos derivadas de un paciente RTT12. Sin embargo, queda por demostrar si la reactivación farmacológica de los genes vinculados con XI es factible in vivo. Un factor limitante es la falta de modelos animales efectivos para medir con precisión la expresión de los genes de la reactivada XI. Hacia este objetivo, se ha generado un Xistδ: MECP2/Xist: modelo de ratón MECP2-GFP que lleva un MECP2 genéticamente etiquetado en XI en todas las células debido a la deleción Heterocigosa en Xist en el cromosoma X materno16. Usando este modelo, la expresión de Mecp2 de XI se ha cuantitado después del tratamiento con inhibidores de xcifs en el cerebro de los ratones vivos. Aquí se describe la generación de xistδ: MECP2/Xist: modelo de ratón MECP2-GFP y metodología para la reactivación de cuantificar XI en neuronas corticales utilizando ensayos basados en inmunofluorescencia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anteriormente, se identificaron XCIFs que son requeridos selectivamente para el silenciamiento de genes ligados a XI en células femeninas de mamíferos12. Además, optimizamos potentes inhibidores de moléculas pequeñas para apuntar a XCIFs, como ACVR1 y efectores descendentes de PDPK1, que reactivan eficientemente el Mecp2 ligado a XI en líneas celulares de fibroblastos de ratón, neuronas corticales de ratón y una célula de fibroblastos humanos línea derivada de un paciente con RT…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Antonio Bedalov por aportar reactivos; Centro de histología de tejido de la Universidad de Virginia para criseccionamiento; Núcleo de citometría de flujo de la Universidad de Virginia para análisis de citometría de flujo; Christian Blue y Saloni Singh por asistencia técnica con genotipado. Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación Double Hoo a Z.Z., y un programa de proyecto piloto otorgado por el Premio de la Universidad de Virginia-Virginia Tech Seed Fund y el Premio de investigación biomédica individual de la Fundación Hartwell a S.B.
Materials
| MICE | |||
| Mecp2tm3.1Bird | The Jackson Laboratory | #014610 | |
| B6;129-Xist (tm5Sado) | provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle | ||
| REAGENTS | |||
| 22×22 mm coverslip | FISHERfinest (Fisher Scientific) | 125488 | |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| 50 ml syringe | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| 60mm culture dish | CellStar | 628160 | |
| 7-AAD | BioLegend | 420403 | |
| ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Chemical | A661-3 | |
| anti-GFP-AlexaFluor647 | Invitrogen | A-31852 | |
| anti-MAP2 | Aves Labs | MAP | |
| BSA | Promega | R396D | |
| Buprenorphine SR | Zoopharm | ||
| citric acid | Sigma | C-1857 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| fetal bovine serum (FBS) | VWR Life Science | 89510-198 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| glass slides | Fisherbrand | 22-034-486 | |
| goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody | Aves Labs | F-1005 | |
| GSK650394 | ApexBio | B1051 | |
| hamilton 10μl syringe | Hamilton Sigma-Aldrich | 28615-U | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-092 | |
| Ketamine | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | |
| Large blunt/blunt curved scissors | Fine Science Tools | 14519-14 | |
| LDN193189 | Cayman Chemicals | 11802 | |
| lodixanol | Sigma | 1343517 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Chemical | M35-212 | |
| Methylcelulose | Sigma | M0262-100G | |
| mounting medium with DAPI | Vectashield | H-1200 | |
| Needle tip, 26 GA x 1.25" | PrecisionGlide | 305111 | |
| ophthalmic ointment | Refresh Lacri-Lube | 93468 | |
| optimal cutting temperature (O.C.T.) | ThermoFisher | ||
| PCR mix | |||
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS) | Corning Cellgro | 46-103-CM | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P330-500 | |
| scalpel blades | |||
| Shallow glass or plastic tray | |||
| skin glue/tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| sodium azide | Fisher Scientific | CAS 26628-22-8 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S642-212 | |
| standard hemostat forceps | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Straight iris scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Tris-base | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| Xylazine | Akorn | NDC: 59399-111-50 | |
| EQUIPMENT | |||
| Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope | Zeiss | Zeiss AxioObserver | |
| 0.45mm burr | IDEAL MicroDrill | 67-1000 | |
| BD FACScalibur | |||
| centrifuge | |||
| glass homogenizer | |||
| cell culture incubator | Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i | 13-998-213 | |
| Leica 3050S research cryostat | |||
| stereotactic platform | |||
| thermocycler | |||
| Timer | |||
| ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima L-100 XP | ||
| Water bath (37 ºC) | Fisher Scientific Isotemp 2239 |
Referências
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