En icke-slumpmässig mus modell för farmakologisk Reaktive ring av Mecp2 på inaktiva X-kromosomen
Summary
Här, vi beskriver ett protokoll för att generera en livskraftig kvinnlig murina modell med icke-slumpmässiga X-kromosomen inaktive ring, dvs, den maternella-ärvda X-kromosomen är inaktiv i 100% av cellerna. Vi beskriver också ett protokoll för att testa genomförbarhet, tolerabilitet och säkerhet för farmakologisk reaktive ring av den inaktiva X-kromosomen in vivo.
Abstract
X-kromosom inaktive ring (XCI) är slumpmässig dämpning av en X-kromosom hos Honor för att uppnå gen dos balans mellan könen. Som ett resultat, alla Honor är heterozygot för X-länkade gen uttryck. En av de viktigaste regulatorerna av XCI är xist, vilket är viktigt för initiering och underhåll av xci. Tidigare studier har identifierat 13 trans verkande X kromosom inaktive rings faktorer (XCIFs) med hjälp av en storskalig, förlust av funktion genetisk skärm. Hämning av XCIFs, såsom ACVR1 och PDPK1, med kort-hårnål RNA eller små molekyl hämmare, reaktiverar X kromosom-länkade gener i odlade celler. Men genomförbarheten och tolerabiliteten för återaktivering av den inaktiva X-kromosomen in vivo återstår att fastställa. Mot detta mål, en Xistδ: Mecp2/xist: Mecp2-GFP mus modell har genererats med icke-Random xci på grund av radering av xist på en X-kromosom. Med den här modellen kvantifierades omfattningen av den inaktiva X-reaktiveringen i mus hjärnan efter behandling med XCIF-hämmare. Nyligen publicerade resultat visar, för första gången, att farmakologisk hämning av XCIFs reaktiverar Mecp2 från inaktiva X-kromosomen i kortikala nerv celler i levande mus hjärna.
Introduction
X-kromosom inaktive ring (XCI) är en process för DOS kompensation som balanserar X-länkade gen uttryck genom att tysta en kopia av X-kromosomen hos Honor1. Som ett resultat, den inaktiva X-kromosomen (XI) ackumuleras karakteristiska egenskaper hos Heterokromatin inklusive DNA-metylering och hämmande histonmodifieringar, såsom Histon H3-lysin 27 trimetylering (H3K27me3) och Histon H2A ubikvitineras (H2Aub) 2. befälhavaren regulator av x-kromosom ljud dämpning är x-inactivation Center (XIC) region, cirka 100 − 500 KB, som styr räkning och ihopkoppling av x-kromosomer, det slumpmässiga valet av x-kromosomen för inaktive ring, och initiering och spridning av ljud dämpning längs X-kromosomen3. Processen för X inaktive ring initieras av X inaktiva specifika avskrift (xist) som täcker XI i CIS att förmedla kromosom-Wide ljud dämpning och remodel den tredimensionella strukturen av x-kromosom4. Nyligen har flera proteomiska och genetiska skärmar identifierat ytterligare tillsynsmyndigheter för xci, såsom xist samverkande proteiner5,6,7,8,9 , 10 , 11 för att , 12. till exempel, en tidigare studie med en opartisk GENOMTÄCKANDE RNA-interferensskärm identifierade 13 trans-acting xci-faktorer (xcifs)12. Mekanistiskt, XCIFs reglera xist uttryck och därför stör xcifs funktion orsakar defekta xci12. De senaste framstegen inom området har tillsammans gett viktiga insikter i de molekyl ära maskiner som krävs för att initiera och underhålla XCI.
Identifiering av xci regulatorer och förstå deras mekanism i xci är direkt relevant för X-länkade mänskliga sjukdomar, såsom Rett syndrom (RTT)13,14. RTT är en sällsynt neuroutvecklingsstörning som orsakas av en heterozyma mutation i X-länkade metyl-CpG bindande protein 2 (MECP2) som drabbar övervägande flickor15. Eftersom MECP2 ligger på X-kromosomen, RTT flickor är heterozygot för MECP2 -brist med ~ 50% celler uttrycker vild-typ och ~ 50% uttrycker Mutant MECP2. Särskilt, RTT Mutant celler hamn en vilande men vild-typ kopia av Mecp2 på XI, som ger en källa till den funktionella genen, som om återaktiveras, skulle kunna lindra symtom på sjukdomen. Förutom RTT, det finns flera andra X-länkade mänskliga sjukdomar, för vilka reaktive ring av XI representerar en potentiell terapeutisk metod, såsom DDX3X syndrom.
Hämning av XCIFs, 3-fosfoinositid beroende protein Kinas-1 (PDPK1), och Activin A receptor typ 1 (ACVR1), antingen genom kort hårnål RNA (shRNA) eller små molekyl hämmare, reaktiverar XI-länkade gener12. Farmakologisk reaktive ring av XI-länkade gener observeras i olika ex vivo-modeller som inkluderar mus fibroblast cellinjer, vuxna mus kortikala nerv celler, mus embryonala fibroblaster, och fibroblast cellinjer som härrör från en RTT patient12. Om farmakologisk reaktive ring av XI-länkade gener är genomförbar in vivo återstår dock att påvisa. En begränsande faktor är avsaknaden av effektiva djur modeller för att noggrant mäta uttrycket av gener från reaktive rad XI. Mot detta mål, en xistδ: Mecp2/xist: Mecp2-GFP mus modell har genererats som bär en genetiskt märkt Mecp2 på XI i alla celler på grund av heterozygot radering i xist på moderns X-kromosom16. Med denna modell har uttrycket Mecp2 från XI kvantifierats efter behandling med xcifs-hämmare i hjärnan hos levande möss. Här, generationen av Xistδ: Mecp2/xist: Mecp2-GFP mus modell och metodik för att kvantifiera XI reaktive ring i kortikala nerv celler med hjälp av immunofluorescence-baserade analyser beskrivs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidigare identifierades de XCIFs-celler som selektivt krävs för ljud dämpning av XI-länkade gener i kvinno cellerna12. Vi ytterligare optimerade potenta små molekyl hämmare att rikta xcifs, såsom ACVR1 och nedströms manipulatorer av PDPK1, som effektivt återaktivera XI-länkade Mecp2 i mus fibroblast cellinjer, mus kortikala nerv celler, och en mänsklig fibroblast cell linje som härrör från en RTT-patient. Dessa resultat tyder på att XI reaktive ring är en trovärdig terape…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Antonio Bedalov för att tillhandahålla reagenser; University of Virginia vävnad histologi Core för krysnittning; University of Virginia Flow Cytometri kärna för flödescytometri analys; Christian Blue och Saloni Singh för teknisk assistans med genotypning. Detta arbete stöddes av en Double Hoo Research Grant till Z.Z., och en pilot projekt program Award från University of Virginia-Virginia Tech Seed Fund Award och Hartwell stiftelsen individuell biomedicinsk forskning Award till S.B.
Materials
| MICE | |||
| Mecp2tm3.1Bird | The Jackson Laboratory | #014610 | |
| B6;129-Xist (tm5Sado) | provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle | ||
| REAGENTS | |||
| 22×22 mm coverslip | FISHERfinest (Fisher Scientific) | 125488 | |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| 50 ml syringe | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| 60mm culture dish | CellStar | 628160 | |
| 7-AAD | BioLegend | 420403 | |
| ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Chemical | A661-3 | |
| anti-GFP-AlexaFluor647 | Invitrogen | A-31852 | |
| anti-MAP2 | Aves Labs | MAP | |
| BSA | Promega | R396D | |
| Buprenorphine SR | Zoopharm | ||
| citric acid | Sigma | C-1857 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| fetal bovine serum (FBS) | VWR Life Science | 89510-198 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| glass slides | Fisherbrand | 22-034-486 | |
| goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody | Aves Labs | F-1005 | |
| GSK650394 | ApexBio | B1051 | |
| hamilton 10μl syringe | Hamilton Sigma-Aldrich | 28615-U | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-092 | |
| Ketamine | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | |
| Large blunt/blunt curved scissors | Fine Science Tools | 14519-14 | |
| LDN193189 | Cayman Chemicals | 11802 | |
| lodixanol | Sigma | 1343517 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Chemical | M35-212 | |
| Methylcelulose | Sigma | M0262-100G | |
| mounting medium with DAPI | Vectashield | H-1200 | |
| Needle tip, 26 GA x 1.25" | PrecisionGlide | 305111 | |
| ophthalmic ointment | Refresh Lacri-Lube | 93468 | |
| optimal cutting temperature (O.C.T.) | ThermoFisher | ||
| PCR mix | |||
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS) | Corning Cellgro | 46-103-CM | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P330-500 | |
| scalpel blades | |||
| Shallow glass or plastic tray | |||
| skin glue/tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| sodium azide | Fisher Scientific | CAS 26628-22-8 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S642-212 | |
| standard hemostat forceps | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Straight iris scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Tris-base | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| Xylazine | Akorn | NDC: 59399-111-50 | |
| EQUIPMENT | |||
| Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope | Zeiss | Zeiss AxioObserver | |
| 0.45mm burr | IDEAL MicroDrill | 67-1000 | |
| BD FACScalibur | |||
| centrifuge | |||
| glass homogenizer | |||
| cell culture incubator | Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i | 13-998-213 | |
| Leica 3050S research cryostat | |||
| stereotactic platform | |||
| thermocycler | |||
| Timer | |||
| ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima L-100 XP | ||
| Water bath (37 ºC) | Fisher Scientific Isotemp 2239 |
Referências
- Lyon, M. F. X-chromosome inactivation as a system of gene dosage compensation to regulate gene expression. Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology. 36, 119-130 (1989).
- Heard, E. Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome. Current Opinion in Genetics Development. 15 (5), 482-489 (2005).
- Augui, S., Nora, E. P., Heard, E. Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre. Nature Review Genetics. 12 (6), 429-442 (2011).
- Pontier, D. B., Gribnau, J. Xist regulation and function explored. Human Genetics. 130 (2), 223-236 (2011).
- Barnes, C., Kanhere, A. Identification of RNA-Protein Interactions Through In Vitro RNA Pull-Down Assays. Methods in Molecular Biology. 1480, 99-113 (2016).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349 (6245), (2015).
- Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation. Current Biology. 26 (8), R338-R342 (2016).
- Mira-Bontenbal, H., Gribnau, J. New Xist-Interacting Proteins in X-Chromosome Inactivation. Curren Biology. 26 (10), 1383 (2016).
- Ridings-Figueroa, R., et al. The nuclear matrix protein CIZ1 facilitates localization of Xist RNA to the inactive X-chromosome territory. Genes and Development. 31 (9), 876-888 (2017).
- Sunwoo, H., Colognori, D., Froberg, J. E., Jeon, Y., Lee, J. T. Repeat E anchors Xist RNA to the inactive X chromosomal compartment through CDKN1A-interacting protein (CIZ1). Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. , (2017).
- Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (35), 12591-12598 (2014).
- Zoghbi, H. Y., Percy, A. K., Schultz, R. J., Fill, C. Patterns of X chromosome inactivation in the Rett syndrome. Brain Development. 12 (1), 131-135 (1990).
- Anvret, M., Wahlstrom, J. Rett syndrome: random X chromosome inactivation. Clinical Genetics. 45 (5), 274-275 (1994).
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nature Genetics. 23 (2), 185-188 (1999).
- Przanowski, P., et al. Pharmacological reactivation of inactive X-linked Mecp2 in cerebral cortical neurons of living mice. Proceedings of Natlional Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7991-7996 (2018).
- Borensztein, M., et al. Xist-dependent imprinted X inactivation and the early developmental consequences of its failure. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (3), 226-233 (2017).
- Jensen, E. C. Quantitative analysis of histological staining and fluorescence using ImageJ. Anatomical Record (Hoboken). 296 (3), 378-381 (2013).
- Cseke, L. J., Talley, S. M. A PCR-based genotyping method to distinguish between wild-type and ornamental varieties of Imperata cylindrica. Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).
