Um modelo de camundongo não aleatório para reativação farmacológica de Mecp2 no cromossomo X inativo
Summary
Aqui, nós descrevemos um protocolo para gerar um modelo murino fêmea viável com inactivation não-aleatório do cromossoma de x, isto é, o cromossoma de x maternally-herdado é inativo em 100% das pilhas. Nós igualmente descrevemos um protocolo para testar a viabilidade, a tolerabilidade, e a segurança da reactivação farmacológica do cromossoma de X inativo in vivo.
Abstract
A inactivação do cromossoma de x (XCI) é o silenciamento aleatório de um cromossoma de X nas fêmeas para conseguir o equilíbrio da dosagem do gene entre os sexos. Em conseqüência, todas as fêmeas são heterozygous para a expressão X-lig do gene. Um dos principais reguladores da XCI é o Xist, que é essencial para a iniciação e manutenção da XCI. Estudos prévios identificaram 13 fatores de inativação do cromossomo X de ação trans (XCIFs) usando uma tela genética de grande escala e perda de função. A inibição de XCIFs, tais como ACVR1 e PDPK1, usando o RNA Short-hairpin ou os inibidores pequenos da molécula, reativa genes cromossomo X-lig em pilhas cultivadas. Mas a viabilidade e tolerabilidade da reativação do cromossomo X inativo in vivo continua a ser determinada. Para este objetivo, um modelo Xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP mouse foi gerado com XCI não aleatório devido à exclusão de Xist em um cromossomo X. Usando este modelo, a extensão da reativação inativa de X foi quantificados no cérebro do rato depois do tratamento com nervos inibidores de xcif. Os resultados recentemente publicados mostram, pela primeira vez, que a inibição farmacológica de XCIFs reativa Mecp2 do cromossoma de X inativo em neurônios corticais do cérebro vivo do rato.
Introduction
O inativação do cromossoma de x (XCI) é um processo da compensação de dosagem que equilibra a expressão de gene x-lig silenciando uma cópia do cromossoma de x nas fêmeas1. Como resultado, o cromossomo X inativo (XI) acumula características da heterocromatina incluindo metilação do DNA e alterações inibitórias da histona, como a histona H3-lisina 27 trimetilação (H3K27me3) e a histona H2A ubiquitinação (H2Aub) o regulador 2. The mestre do silenciamento do cromossoma de x é a região do centro da x-inactivação (xic), ao redor 100-500 KB, que controla a contagem e o emparelhamento dos cromossomas de x, a escolha aleatória do cromossoma de x para a inactivação, e a iniciação e propagação do silenciamento ao longo do cromossomo X3. O processo de inactivação de X é iniciado pelo transcrito específico inativo de X (Xist) que reveste o XI em cis para mediar o silenciamento do cromossoma-largo e remodela a estrutura tridimensional do cromossoma de x4. Recentemente, diversas telas proteômica e genéticas identificaram reguladores adicionais de XCI, tais como proteínas interagindo do Xist 5,6,7,8,9 , 10 de , 11 anos de , 12. por exemplo, um estudo prévio usando uma tela de interferência de RNA em todo o genoma não tendencioso identificou 13 fatores de XCI Trans-acting (xcifs)12. Mecanisticamente, XCIFs regulam a expressão Xist e, portanto, interferir com a função xcifs causa XCI defeituoso12. Juntos, avanços recentes no campo forneceram insights importantes sobre a maquinaria molecular que é necessária para iniciar e manter o XCI.
A identificação de reguladores de XCI e a compreensão de seu mecanismo em XCI são diretamente relevantes às doenças humanas X-lig, tais como a síndrome de Rett (RTT)13,14. RTT é uma desordem rara do neurodesenvolvimento causada por uma mutação heterozygous na proteína de ligação X-lig de methyl-CpG 2 (MeCP2) que afeta predominantly meninas15. Porque MeCP2 é ficada situada no cromossoma de X, as meninas de RTT são heterozygous para a deficiência de MeCP2 com as pilhas do ~ 50% que expressam o selvagem-tipo e o ~ 50% que expressam o mutante MeCP2. Notàvelmente, as pilhas do mutante de RTT abrigam uma cópia dormente mas selvagem-tipo de Mecp2 no XI, fornecendo uma fonte do gene funcional, que se reactivated, poderia potencial aliviar sintomas da doença. Além do que o RTT, há diversas outras doenças humanas lig X, para que o reativação de Xi representa uma aproximação terapêutica potencial, tal como a síndrome de DDX3X.
A inibição de XCIFs, A proteína quinase-1 dependente de 3-Fosfoinositídeo (PDPK1), e o tipo 1 do receptor do activina A (ACVR1), pelo RNA curto do hairpin (shRNA) ou pelos inibidores pequenos da molécula, reativam genes XI-lig12. O reativação farmacológico de genes XI-lig é observado em vários modelos ex vivo que incluem linhas de pilha do fibroblasto do rato, neurônios corticais adultos do rato, fibroblasto embrionário do rato, e as linhas de pilha do fibroblasto derivadas de um paciente de RTT12. Entretanto, se a reactivação farmacológica de genes XI-lig é viável in vivo permanece ser demonstrado. Um fator limitante é a falta de modelos animais eficazes para medir com precisão a expressão de genes de Xi reativado. Para este objetivo, um Xistδ: Mecp2/Xist: modelo do rato de Mecp2-GFP foi gerado que carreg um Mecp2 genetically etiquetado em XI em todas as pilhas devido ao apagamento heterozygous em Xist no cromossoma de X materno16. Usando este modelo, a expressão de Mecp2 de Xi foi quantificados depois do tratamento com nervos inibidores de xcifs no cérebro de ratos vivos. Aqui, a geração do modelo xistδ: Mecp2/Xist: Mecp2-GFP mouse e metodologia para quantificar XI reativação em neurônios corticais usando ensaios baseados em imunofluorescência é descrita.
Protocol
Representative Results
Discussion
Previamente, os XCIFs que são seletivamente exigidos para silenciar de genes XI-lig em pilhas fêmeas mamíferas foram identificados12. Nós otimizamos ainda mais potentes inibidores de moléculas pequenas para direcionar XCIFs, como ACVR1 e efetores a jusante de PDPK1, que reativam eficientemente Mecp2 em linhas de células de fibroblastos do mouse, neurônios corticais do mouse e uma célula de fibroblastos humanos linha derivada de um paciente com RTT. Estes resultados sugerem que o r…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem a Antonio Bedalov por fornecer reagentes; Universidade do núcleo da histologia do tecido de Virgínia para cryosectioning; Núcleo de citometria de fluxo da Universidade de Virginia para análise de citometria de fluxo; Christian Blue e SALONI Singh para assistência técnica com genotipagem. Este trabalho foi apoiado por uma concessão da pesquisa dobro do hoo a Z.Z., e por um prêmio do programa piloto do projeto da Universidade do prêmio da semente do fundo da tecnologia de Virgínia-Virgínia e do prêmio de pesquisa biomédico individual da Fundação de Hartwell a SB
Materials
| MICE | |||
| Mecp2tm3.1Bird | The Jackson Laboratory | #014610 | |
| B6;129-Xist (tm5Sado) | provided by Antonio Bedalov, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle | ||
| REAGENTS | |||
| 22×22 mm coverslip | FISHERfinest (Fisher Scientific) | 125488 | |
| 32% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | |
| 50 ml syringe | Medline Industries | NPMJD50LZ | |
| 60mm culture dish | CellStar | 628160 | |
| 7-AAD | BioLegend | 420403 | |
| ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Chemical | A661-3 | |
| anti-GFP-AlexaFluor647 | Invitrogen | A-31852 | |
| anti-MAP2 | Aves Labs | MAP | |
| BSA | Promega | R396D | |
| Buprenorphine SR | Zoopharm | ||
| citric acid | Sigma | C-1857 | |
| DMSO | Fisher Bioreagents | BP231-100 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Ethanol | Decon Labs | 2701 | |
| fetal bovine serum (FBS) | VWR Life Science | 89510-198 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | |
| glass slides | Fisherbrand | 22-034-486 | |
| goat anti-chicken FITC-labeled secondary antibody | Aves Labs | F-1005 | |
| GSK650394 | ApexBio | B1051 | |
| hamilton 10μl syringe | Hamilton Sigma-Aldrich | 28615-U | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-092 | |
| Ketamine | Ketaset | NDC 0856-2013-01 | |
| Large blunt/blunt curved scissors | Fine Science Tools | 14519-14 | |
| LDN193189 | Cayman Chemicals | 11802 | |
| lodixanol | Sigma | 1343517 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Chemical | M35-212 | |
| Methylcelulose | Sigma | M0262-100G | |
| mounting medium with DAPI | Vectashield | H-1200 | |
| Needle tip, 26 GA x 1.25" | PrecisionGlide | 305111 | |
| ophthalmic ointment | Refresh Lacri-Lube | 93468 | |
| optimal cutting temperature (O.C.T.) | ThermoFisher | ||
| PCR mix | |||
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate buffered saline pH 7.4 (PBS) | Corning Cellgro | 46-103-CM | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P330-500 | |
| scalpel blades | |||
| Shallow glass or plastic tray | |||
| skin glue/tissue adhesive | 3M Vetbond | 1469SB | |
| sodium azide | Fisher Scientific | CAS 26628-22-8 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S642-212 | |
| standard hemostat forceps | Fine Science Tools | 13013-14 | |
| Standard tweezers | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Straight iris scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Tris-base | Fisher Bioreagents | BP152-5 | |
| Triton X-100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| Xylazine | Akorn | NDC: 59399-111-50 | |
| EQUIPMENT | |||
| Zeiss AxioObserver Live-Cell microscope | Zeiss | Zeiss AxioObserver | |
| 0.45mm burr | IDEAL MicroDrill | 67-1000 | |
| BD FACScalibur | |||
| centrifuge | |||
| glass homogenizer | |||
| cell culture incubator | Thermo Scientific HERACELL VIOS 160i | 13-998-213 | |
| Leica 3050S research cryostat | |||
| stereotactic platform | |||
| thermocycler | |||
| Timer | |||
| ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima L-100 XP | ||
| Water bath (37 ºC) | Fisher Scientific Isotemp 2239 |
Referências
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