ショウジョウバエメラノガスターにおけるクエン酸シンターゼ活性の比色アッセイ
Summary
ショウジョウバエ組織ホモジネテスにおける無傷のミトコンドリア塊を定量するためのクエン酸シンターゼ活性の比色アッセイのためのプロトコルを提示する。
Abstract
ミトコンドリアは、酸化リン酸化を通じてATPを産生し、様々な生理学的プロセスを調節することにより、細胞代謝において最も顕著な役割を果たしています。ミトコンドリア機能不全は、多くの代謝および神経変性疾患の主な原因である。無傷のミトコンドリアは、その適切な機能のために重要です.クエン酸酵素シンターゼはミトコンドリアマトリックスに局在しているため、無傷のミトコンドリア塊の定量酵素マーカーとして使用することができます。ミトコンドリアで重要な機能を持つ多くの分子や経路がヒトとショウジョウバレの間で高度に保存されており、ショウジョウバアラで強力な遺伝的ツールの配列が利用可能であることを考えると、ショウジョウバヤはミトコンドリア機能を研究するための良いモデルシステムとして機能します。ここでは、ミトコンドリアを単離することなく、成体ハエ由来の組織ホモジネートにおけるクエン酸シンターゼ活性を迅速かつ簡単に測定するためのプロトコルを提示する。このプロトコルはまた、幼虫、培養細胞、および哺乳動物組織におけるクエン酸シンターゼ活性を測定するのに適している。
Introduction
ミトコンドリアは、トリカルボン酸サイクル(すなわち、クレブスサイクル)および酸化リン酸化を介してエネルギー通貨ATPを生成するほとんどの真核生物における発電性オルガネラとして最もよく知られています。ミトコンドリアはまた、アポトーシス1、Ca2+恒常性2、3、反応性酸化種(ROS)生成4、および小胞体(ER)ストレス応答5の調節など、他の多くの生理学的過程において重要な役割を果たすることが判明している。ミトコンドリア機能障害は、任意の年齢で体内の任意の臓器に影響を与えることができるし、代謝、老化関連6、および神経変性疾患の主な原因である7。無傷のミトコンドリアは、ミトコンドリア機能に機械的に関連しています。従って、ミトコンドリア質量の適切な定量は、ミトコンドリア機能8を評価するために非常に重要である。クエン酸シンターゼは、トリカルボン酸サイクル9の第1工程における速度制限酵素であり、真核細胞内のミトコンドリアマトリックスに局在し、従って無傷のミトコンドリア質量9、10の存在のための定量マーカーとして使用することができる。クエン酸シンターゼ活性は、無傷のミトコンドリアタンパク質11、12の正規化因子としても使用することができる。
フルーツフライ、ショウジョウバエメラノガスターは、ミトコンドリアで重要な役割を果たす多くの分子および経路がショウジョウバエからヒト13、14、15に進化的に保存されているので、ミトコンドリア機能を研究するための優れたモデルシステムである。ここでは、ショウジョウバエ組織中の比色アッセイによるクエン酸シンターゼ活性を96ウェルプレート形式で均質化するクエン酸シンターゼ活性を測定するための迅速かつ簡単な方法のためのプロトコルを提示する。クエン酸シンターゼ活性アッセイにおいて、ショウジョウバエ組織中のクエン酸シンターゼは、アセチル補酵素A(アセチルCoA)とオキサロ酢酸塩の反応を触媒し、クエン酸CoA-SHおよびH+を形成する。CoA-SHはその後、5,5′-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(DTNB)と反応して着色物を生成し、2-ニトロ-5-チオ安息香酸塩(TNB)を生成し、412nmで分光法で容易に測定することができる。クエン酸シンターゼ活性は、色の生産速度によって反映することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ショウジョウバエをモデルとして使用した代謝研究は、ハエ18の遺伝的背景、食事、およびストックメンテナンスを考慮する必要があります。クエン酸シンターゼ活性の測定に異なる遺伝的背景の影響を避けるために、ショウジョウバエの異なる株は、10世代のコントロール株にバッククロスする必要があります。我々の実験で使用されるすべてのショウジ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国立自然科学財団(31401013および31471010)、上海市科学技術委員会、上海浦江プログラム(14PJ1405900)、自然科学財団の助成金によって支援されました。上海 (19ZR1446400).
Materials
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pellet pestle | Sangon | F619072 | |
| Pellet pestle motor | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plate reader | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay kit | Beyotime | P0010S | |
| Scissors | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
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