Ein kolorimetrischer Test der Citrat-Synthase-Aktivität in Drosophila Melanogaster
Summary
Wir präsentieren ein Protokoll für einen kolorimetrischen Test der Citratsynthase-Aktivität zur Quantifizierung intakter mitochondrialer Masse in Drosophila-Gewebehomogenaten.
Abstract
Mitochondrien spielen die wichtigste Rolle im Zellstoffwechsel, indem sie ATP durch oxidative Phosphorylierung produzieren und eine Vielzahl von physiologischen Prozessen regulieren. Mitochondriale Dysfunktion ist eine primäre Ursache für eine Reihe von metabolischen und neurodegenerativen Erkrankungen. Intakte Mitochondrien sind entscheidend für ihr ordnungsgemäßes Funktionieren. Das Enzym Citratsynthase ist in der mitochondrialen Matrix lokalisiert und kann somit als quantitativer Enzymmarker intakter mitochondrialer Masse verwendet werden. Angesichts der Tatsache, dass viele Moleküle und Wege, die wichtige Funktionen in Mitochondrien haben, sind stark zwischen Menschen und Drosophilakonserviert, und dass eine Reihe von leistungsfähigen genetischen Werkzeugen in Drosophilazur Verfügung stehen, Drosophila dient als ein gutes Modellsystem für die Untersuchung mitochondriale Funktion. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur schnellen und einfachen Messung der Citrat-Synthase-Aktivität in Gewebehomogenat von erwachsenen Fliegen, ohne Mitochondrien zu isolieren. Dieses Protokoll eignet sich auch zur Messung der Citratsynthase-Aktivität in Larven, kultivierten Zellen und Säugetiergeweben.
Introduction
Mitochondrien sind am besten bekannt als die kraftproduzierenden Organellen in den meisten eukaryotischen Organismen, die die Energiewährung ATP durch den Tricarbonsäurezyklus (d.h. Krebs-Zyklus) und oxidative Phosphorylierung produzieren. Mitochondrien werden auch gefunden, um wichtige Rollen in vielen anderen physiologischen Prozessen zu spielen, wie Regulierung der Apoptose1, Ca2+ Homöostase2,3, reaktive Oxidation Spezies (ROS) Generation4, und endoplasmisches Retikulum (ER)-Stress-Antwort5. Mitochondriale Dysfunktion kann jedes Organ im Körper in jedem Alter beeinflussen und ist eine primäre Ursache für metabolische, Alterungs-bedingte6, und neurodegenerative Erkrankungen7. Intakte Mitochondrien sind mechanistisch mit der mitochondrialen Funktion verwandt. Daher ist eine korrekte Quantifizierung der intakten mitochondrialen Masse sehr wichtig für die Bewertung der mitochondrialen Funktion8. Citrat-Synthase, ein ratenbegrenzendes Enzym im ersten Schritt des Tricarbonsäurezyklus9, ist in der mitochondrialen Matrix innerhalb eukaryotischer Zellen lokalisiert und kann daher als quantitativer Marker für das Vorhandensein intakter mitochondrialer Masse9,10verwendet werden. Citrat-Synthase-Aktivität kann auch als Normalisierungsfaktor für intakte mitochondriale Proteine11,12verwendet werden.
Die Fruchtfliege, Drosophila melanogaster, ist ein ausgezeichnetes Modellsystem für das Studium der mitochondrialen Funktion, da viele Moleküle und Wege, die eine zentrale Rolle in Mitochondrien spielen, evolutionär von Drosophila bis zum Menschen konserviert werden13,14,15. Hier stellen wir ein Protokoll zur schnellen und einfachen Methode zur Messung der Citrat-Synthase-Aktivität durch einen kolorimetrischen Assay in Drosophila-Gewebehomogenaten 16 in einem 96-Well-Platten-Format vor. Im Citrat-Synthase-Aktivitätstest katalysiert Citrat-Synthase in Drosophila-Gewebehomogenat die Reaktion von Oxaloacetat mit Acetylcoenzym A (Acetyl CoA) zu dem Citrat CoA-SH und H+. CoA-SH reagiert anschließend mit 5,5′-Dithiobis-(2-Nitrobenzoesäure) (DTNB) und erzeugt ein farbiges Produkt, 2-Nitro-5-Thiobenzoat (TNB), das bei 412 nm spektrophotometrisch leicht gemessen werden kann. Die Citrat-Synthase-Aktivität kann durch die Rate der Farbproduktion widergespiegelt werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metabolische Studien mit Drosophila als Modell müssen den genetischen Hintergrund, die Ernährung und die Bestandspflege der Fliegen berücksichtigen18. Um die Auswirkungen unterschiedlicher genetischer Hintergründe auf die Messung der Citrat-Synthase-Aktivität zu vermeiden, sollten verschiedene Stämme von Drosophila für 10 Generationen auf den Kontrollstamm zurückgekreuzt werden. Der genetische Hintergrund aller Drosophila-Stämme, die in unseren Experimenten verw…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die Stipendien der National Natural Science Foundation of China (31401013 und 31471010), der Wissenschafts- und Technologiekommission der Shanghai Municipality, shanghai Pujiang Program (14PJ1405900) und der Natural Science Foundation of Shanghai (19ZR1446400).
Materials
| 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | V900477 | |
| 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol (TRIZMA Base) | Sigma-Aldrich | V900483 | |
| Acetyl-CoA | Sigma-Aldrich | A2181 | |
| Dithio-bis-nitrobenzoic acid (DTNB) | Sigma-Aldrich | D8130 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | V900106 | |
| Oxaloacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | |
| Pellet pestle | Sangon | F619072 | |
| Pellet pestle motor | Tiangen | OSE-Y10 | |
| Plate reader | BioTek | Eon | |
| Protein BCA Assay kit | Beyotime | P0010S | |
| Scissors | WPI | 14124 | |
| Triton X-100 | Sangon | A110694-0100 |
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