ポマリドマイドベースのホモ・プロタクによるE3ユビキチン・リゲス・セレブロンの化学的不活性化
Summary
本研究では、サリドマイド類似体の標的であるE3ユビキチン・リゲス・セレブロン(CRBN)のユビキチン化および分解を誘導する新規アプローチとして、ポマリドマイドベースの二機能ホモ-PROTACの合成と特徴付けについて述べている。
Abstract
免疫調節薬(IMiDs)サリドマイドおよびその類似体、レナリドミドおよびポマリドマイド、多発性骨髄腫の治療のためのすべてのFDA承認薬は、リンパ球転写因子イカロス(IKZF1)およびアイオロスのユビキチン化および分解を誘導する(IKZF3)プロテアソメ分解のためのセレブロン(CRBN)E3ユビキチンリゲスを介して。IMiDsは最近、CRBN E3リゲスによるユビキチン化およびプロテアソーム分解のための他のタンパク質を標的とするキメラ(PROTAC)を標的とする二機能性プロテオリシスの生成に利用されている。ポマリドマイドベースのホモビ機能PROTACを設計・合成し、CRBNの自己指向ユビキチン化と分解を誘導する能力を解析した。ここで、CRBNは、E3ユビキチンライゲスとターゲットの両方を同時に機能する。ホモ-PROTAC化合物8は、IKZF1およびIKZF3に対する残りの影響を最小限に抑えながら、高い効力を持つCRBNを分解します。化合物8によるCRBN不活性化は、細胞生存率および異なる多発性骨髄腫細胞株の増殖に影響を及ぼさなかった。このホモ-PROTACは、多発性骨髄腫細胞におけるIMiDsの効果を損なう。したがって、当社のホモディメリックポマリドミド系化合物は、CRBNの内因性基質と生理機能を同定し、IMIDsの分子機構を調るのに役立つ可能性があります。
Introduction
免疫調節薬(IMiDs)サリドマイドおよびその類似体、レナリドミドおよびポマリドマイドは、すべて多発性骨髄腫の治療のために承認され、E3ユビキチンリゲスセレブロン(CRBN)、カリン4A-RING E3ユビキチンリゲスの基板アダプターに結合する(CRL4CRBN)1,2,3.IMiDsの結合は、リンパ球転写因子イカロス(IKZF1)およびアイオロス(IKZF3)に対するCRL4CRBNの親和性を高め、そのユビキチン化と劣化を引き起こし(図1)4、5、 6,7,8.IKZF1およびIKZF3は多発性骨髄腫細胞に不可欠であるため、それらの不活性化は増殖抑制をもたらす。SALL4は最近、サリドマイド9、10によって引き起こされた1950年代のテラトジェニシティといわゆるコンテルガン大惨事の原因となる可能性が高いCRBNの追加IMiD誘発ネオ基板として発見された。対照的に、カゼインキナーゼ1α(CK1α)は、染色体5q欠失11を有する骨髄異形成症候群における治療効果に関与するCRBNのレナリドミド特異的基質である。
分解のために特定のタンパク質を標的とする低分子の能力は、現代の薬剤開発にとってエキサイティングな意味を持っています。サリドマイドとその類似体のメカニズムは、ヒトで初めて使用された後に発見されたが、いわゆるPrオテオリシスTaはCヒデラス(PROTAC)と呼ばれ、目的のタンパク質(POI)を特異的に標的にするように設計されている(図)2)12,13,14,15,16,17,18.PROACは、CRBNまたはフォンヒッペルリンダウ(VHL)18、19、20、CRBNのようなE3ユビキチンリガーゼのリガンドにリンカーを介して接続されたPOIのための特定のリガンドからなるヘテロビ機能分子である。 21、22。PROTACは一過性三項複合体の形成を誘発し、POIをE3ユビキチンリゲスに導き、そのユビキチン化およびプロテアソーム分解をもたらす。従来の阻害剤に比べてPROTACの主な利点は、POIへの結合がその阻害よりも十分であり、したがって、PROTACは、薬物使用不能と考えられていたものを含む、はるかに広い範囲のタンパク質を標的にする可能性があることです。転写因子15.さらに、キメラ分子は触媒的に作用するため、高い効力を有する。POIへのユビキチン転移後、三項複合体は解離し、新しい複合体の形成に利用できる。したがって、非常に低いPROTAC濃度は、標的タンパク質23の分解のために十分である。
ここでは、それ自体の劣化のためにCRBNを募集するポマリドマイド-ポマリドマイド共役ホモ-PROTAC(化合物8)の合成について説明する24.E3ユビキチン・リガーゼCRBNは、リクルーターとターゲットの両方を同時に務めます(図3)。データを検証するために、負の結合制御(化合物9)も合成しました。 我々のデータは、新たに合成されたホモ-PROTACがCRBN分解に特異的であり、他のタンパク質に対する影響が最小限であることを確認します。
Protocol
Representative Results
Discussion
CRBNのためにここに説明するこのようなホモPROTACの設計は、多くのヘテロビ機能PROTACでうまく利用され、PROTAC 8の高度な開発をもたらしたCRBNに対するポマリドミドの特定の親和性に依存しています。選択的 CRBN デグレーダー。我々の分子の特異性は、プロテオミクス分析24によって既に確認されている。遺伝的に媒介されたノックアウトのために、 副作用の排除?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ドイツのフォルシュンゲミンシャフト(エミーノエーテルプログラムKr-3886/2-1とSFB-1074からJ.K.まで)によってサポートされました。FOR2372 から M.G.
Materials
| 1,1'-Carbonyldiimidazole | TCI chemicals | C0119 | |
| 2,2′-(Ethylenedioxy)-bis(ethylamine) | Sigma-Aldrich | 385506 | Compound 6 |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 3-Fluorophthalic anhydride, 98 % | Alfa Aesar | A12275 | |
| 4-Dimethylaminopyridine, 99 % | Acros | 148270250 | Toxic |
| Acrylamidstammlösung/ Bisacrylamid (30%/0,8%) | Carl Roth | 3029.1 | |
| Aiolos (D1C1E) mAB | Cell signaling | 15103S | |
| Anti-CRBN antibody produced in rabbit | Sigma | HPA045910 | |
| Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody | Sigma | 7074S | |
| Ammonium Persulfate | Roth | 9592.2 | |
| Boc-Gln-OH | TCI chemicals | B1649 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay | Promega | G7571 | |
| ChemiDoc XRS+ | Bio-Rad | 1708265 | |
| DMF, anhydrous, 99.8 % | Acros | 348435000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| DMSO, anhydrous, 99.7 % | Acros | 348445000 | Extra Dry over Molecular Sieve |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Goat anti-mouse (HRP conjugated) | Santa Cruz biotechnology | sc-2005 | |
| Halt Protease & Phosphatase Inhibitor Single-use Cocktail (100X) | Thermo Scientific | 1861280 | |
| Ikaros (D6N9Y) Mab | Cell signaling | 14859S | |
| ImmobilonP Transfer Membrane (0,45µm) | Merck | IPVH000010 | |
| Iodomethane, 99 % | Sigma-Aldrich | I8507 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213-2.5L | |
| Mg132 | Selleckchem | S2619 | |
| Mini Trans-Blot electrophoretic transfer cell | Bio-Rad | 1703930 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658004 | |
| MLN4942 | biomol (cayman) | Cay15217-1 | |
| Monoclonal Anti-α-Tubulin antibody produced in mouse (B512) | Sigma | T5168 | |
| N-Ethyldiisopropylamine, 99 % | Alfa Aesar | A11801 | |
| Nonfat dried milk powder | PanReac AppliChem | A0830,0500 | |
| Nunc F96 MicroWell White Polystyrene Plate | Thermo Scientific | 136101 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | |
| Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Pomalidomide | Selleckchem | S1567 | |
| RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46430 | |
| sodium dodecyl sulfate | Carl Roth | 183.1 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | A9539-500g | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| tert-Butyl N-[2-[2-(2-aminoethoxy)ethoxy]ethyl]carbamate | Sigma-Aldrich | 89761 | Compound 5 |
| Tricin | Carl Roth | 6977.4 | |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1kg | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| WesternBright ECL spray | Advansta | K-12049-D50 |
Referências
- Ito, T., et al. Identification of a primary target of thalidomide teratogenicity. Science. 327 (5971), 1345-1350 (2010).
- Lopez-Girona, A., et al. Cereblon is a direct protein target for immunomodulatory and antiproliferative activities of lenalidomide and pomalidomide. Leukemia. 26 (11), 2326-2335 (2012).
- Fischer, E. S., et al. Structure of the DDB1-CRBN E3 ubiquitin ligase in complex with thalidomide. Nature. 512 (7512), 49-53 (2014).
- Gandhi, A. K., et al. Immunomodulatory agents lenalidomide and pomalidomide co-stimulate T cells by inducing degradation of T cell repressors Ikaros and Aiolos via modulation of the E3 ubiquitin ligase complex CRL4(CRBN). British Journal of Haematology. 164 (6), 811-821 (2014).
- Kronke, J., Hurst, S. N., Ebert, B. L. Lenalidomide induces degradation of IKZF1 and IKZF3. Oncoimmunology. 3 (7), e941742 (2014).
- Lu, G., et al. The myeloma drug lenalidomide promotes the cereblon-dependent destruction of Ikaros proteins. Science. 343 (6168), 305-309 (2014).
- Zhu, Y. X., Kortuem, K. M., Stewart, A. K. Molecular mechanism of action of immune-modulatory drugs thalidomide, lenalidomide and pomalidomide in multiple myeloma. Leukemia & Lymphona. 54 (4), 683-687 (2013).
- Chamberlain, P. P., et al. Structure of the human Cereblon-DDB1-lenalidomide complex reveals basis for responsiveness to thalidomide analogs. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (9), 803-809 (2014).
- Donovan, K. A., et al. Thalidomide promotes degradation of SALL4, a transcription factor implicated in Duane Radial Ray syndrome. eLife. 7, (2018).
- Matyskiela, M. E., et al. SALL4 mediates teratogenicity as a thalidomide-dependent cereblon substrate. Nature Chemical Biology. 14 (10), 981-987 (2018).
- Kronke, J., et al. Lenalidomide induces ubiquitination and degradation of CK1alpha in del(5q) MDS. Nature. 523 (7559), 183-188 (2015).
- Sakamoto, K. M., et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (15), 8554-8559 (2001).
- Sakamoto, K. M., et al. Development of Protacs to target cancer-promoting proteins for ubiquitination and degradation. Molecular & Cellular Proteomics. 2 (12), 1350-1358 (2003).
- Schneekloth, J. S., et al. Chemical genetic control of protein levels: selective in vivo targeted degradation. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3748-3754 (2004).
- Gu, S., Cui, D., Chen, X., Xiong, X., Zhao, Y. PROTACs: An Emerging Targeting Technique for Protein Degradation in Drug Discovery. Bioessays. 40 (4), e1700247 (2018).
- Collins, I., Wang, H., Caldwell, J. J., Chopra, R. Chemical approaches to targeted protein degradation through modulation of the ubiquitin-proteasome pathway. Biochemical Journal. 474 (7), 1127-1147 (2017).
- Neklesa, T. K., Winkler, J. D., Crews, C. M. Targeted protein degradation by PROTACs. Pharmacology & Therapeutics. 174, 138-144 (2017).
- Winter, G. E., et al. Phthalimide conjugation as a strategy for in vivo target protein degradation. Science. 348 (6241), 1376-1381 (2015).
- Maniaci, C., et al. Homo-PROTACs: bivalent small-molecule dimerizers of the VHL E3 ubiquitin ligase to induce self-degradation. Nature Communications. 8 (1), 830 (2017).
- Crew, A. P., et al. Identification and Characterization of Von Hippel-Lindau-Recruiting Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of TANK-Binding Kinase 1. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
- Lu, J., et al. Hijacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon to Efficiently Target BRD4. Chemistry & Biology. 22 (6), 755-763 (2015).
- Steinebach, C., et al. PROTAC-mediated crosstalk between E3 ligases. Chemical Communications. 55 (12), 1821-1824 (2019).
- Tinworth, C. P., Lithgow, H., Churcher, I. Small molecule-mediated protein knockdown as a new approach to drug discovery. Medchemcomm. 7 (12), 2206-2216 (2016).
- Steinebach, C., et al. Homo-PROTACs for the Chemical Knockdown of Cereblon. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2771-2782 (2018).
- Ambrozak, A., et al. Synthesis and Antiangiogenic Properties of Tetrafluorophthalimido and Tetrafluorobenzamido Barbituric Acids. ChemMedChem. 11 (23), 2621-2629 (2016).
- Zhou, B., et al. Discovery of a Small-Molecule Degrader of Bromodomain and Extra-Terminal (BET) Proteins with Picomolar Cellular Potencies and Capable of Achieving Tumor Regression. Journal of Medicinal Chemistry. , (2017).
- Zhang, C., et al. Proteolysis Targeting Chimeras (PROTACs) of Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK). European Journal of Medicinal Chemistry. 151, 304-314 (2018).
- Runcie, A. C., Chan, K. H., Zengerle, M., Ciulli, A. Chemical genetics approaches for selective intervention in epigenetics. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 186-194 (2016).
- Kronke, J., et al. Lenalidomide causes selective degradation of IKZF1 and IKZF3 in multiple myeloma cells. Science. 343 (6168), 301-305 (2014).
- Eichner, R., et al. Immunomodulatory drugs disrupt the cereblon-CD147-MCT1 axis to exert antitumor activity and teratogenicity. Nature Medicine. 22 (7), 735-743 (2016).
- Zhu, Y. X., et al. Cereblon expression is required for the antimyeloma activity of lenalidomide and pomalidomide. Blood. 118 (18), 4771-4779 (2011).
- Kortum, K. M., et al. Targeted sequencing of refractory myeloma reveals a high incidence of mutations in CRBN and Ras pathway genes. Blood. 128 (9), 1226-1233 (2016).
- Gil, M., et al. Cereblon deficiency confers resistance against polymicrobial sepsis by the activation of AMP activated protein kinase and heme-oxygenase-1. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 976-981 (2018).
- Kim, H. K., et al. Cereblon in health and disease. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 468 (8), 1299-1309 (2016).
- Lee, K. M., et al. Disruption of the cereblon gene enhances hepatic AMPK activity and prevents high-fat diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Diabetes. 62 (6), 1855-1864 (2013).
