בזריקות Vivo גרם סטריאוטקאית לגירוי מגנטי של תשומות לטווח ארוך בפרוסות המוח של העכבר
Summary
פרוטוקול זה מתאר ערכה של שיטות לזיהוי הקישוריות הפונקציונלית הספציפית של כניסות לטווח ארוך מאזורי מוח רחוקים באמצעות הגירוי בתוך המוח בפרוסות מvivo לשעבר.
Abstract
ידיעת הקישוריות הסינפטית הספציפית לסוג תא היא תנאי מוקדם להבנת המעגלים העצביים הכלל-מהותיים. החקירה תפקודית של חיבורים ארוכי טווח דורש הקלטות ממוקדות של נוירונים בודדים בשילוב עם גירוי ספציפי של קלט מרחוק מזוהה. לעתים קרובות קשה להגיע לטכניקות גירוי מקובלות וחשמליות, משום שהאקטונים מאזורי המוח המתקונים עשויים להתערבב באזור המטרה. המיקוד הסטריאוטקאלי של אזור מוחי מסוים לביטוי וירוס-מתווך של ערוצי יון רגישים לאור מאפשר גירוי סלקטיבי של אקטונים שמקורם באותו אזור באור. זריקות סטריאוטקאיות גרם ניתן להשתמש במבנים מופרדים היטב, כגון הגרעין התלמי הקדמי, בנוסף לאזורים משניים או קורטיקליים אחרים ברחבי המוח.
המתואר כאן היא סדרה של טכניקות הזרקה סטריאוטקאית מדויקת של וקטורים וקטורי המבטא המתקשרים במוח העכבר, ואחריו גירוי של מסופי אקסון בהכנת פרוסת המוח. פרוטוקולים אלה הם פשוטים וחלים באופן נרחב. בשילוב עם מהדק תיקון תא שלם הקלטה מתוך תא עצב מחובר postsynaptically, גירוי של אקסונים מאפשר זיהוי של קשרים פונקציונלית סינפטית, אפיון תרופתי, והערכה של כוחם. בנוסף, מילוי ביוציטוטין של תא העצב המוקלט יכול לשמש לזיהוי מורפולוגית שלאחר-הוק של תא העצב הפוסטסינפטית.
Introduction
הגדרת הקישוריות בין אזורי המוח. נחוצה כדי להבין את המעגלים העצביים שיטות האיתור האנטומי הקלאסיות מאפשרות יצירת קישוריות בין-אזורית, ולימודי הנגעים מסייעים להבנת הארגון ההיררכי של זרימת המידע. לדוגמה, מעגלי המוח לאוריינטציה מרחבית וכיוון הראש מעורבים בזרימה כיוונית של מידע מתלמוס ל-presubiculum. זה הוכח על ידי מחקרים נגעים של הגרעין של אנארטרו-טתלמי (adn) כי לבזות את האות בכיוון הראש במורד הזרם presubiculum, כמו גם את המוח של הפרהיפוקאמאל תא1,2.
הקישוריות הפונקציונלית בין אזורי המוח קשה יותר ליצור ברמה התאית והתת-תאית. בהיפוקמפוס, אנטומיה מאורגנת מאוד מאפשר לחקור קשרים סינפטית ספציפיים מסלול באמצעות סימולציה חשמלית בהכנה פרוסה. אלקטרודות גירוי להציב שכבה רדיואטום של CA1 ניתן להשתמש במיוחד לעורר את הקלט הנלווה של שייפר מ CA33. אלקטרודות מעוררות מונחה בשכבה lacunosum מCA1 מפעילים את הכניסה לנתיב הנקבים לCA14,5. גירוי חשמלי מפעיל שחרור נוירוטרנסמיטר ממסופי אקסון; עם זאת, הוא מפעיל נוירונים עם somata ליד האתר גירוי, כמו גם אקסונים של מעבר. לכן, השימוש המוגבל לחקר האפפראנטים מאזורי המוח המוגדרים כאשר סיבים של אזורים שונים של מוצא מתערבבים במבנה היעד, כפי שבדרך כלל המקרה בקליפת הקליפה.
נוירונים יכולים גם להיות מגורה עם אור. שיטות אופטיות כוללות את ההפעלה של גלוטמט בכלוב, אשר ניתן לשלב עם סריקת לייזר אחת או שתיים-פוטון. אתרים מרובים במרווחים מקרוב עשויים להיות מגורה ברציפות, ללא נזק מכני לרקמה6. זה נעשה בהצלחה למפות קולטני סינפטית, כמו גם להפעיל נוירונים בודדים7. בעוד גלוטמט שימוש הזדקנות יכול לשמש ניתוח מעגל מקומי, זה לא מאפשר הפעלה ספציפית של תשומות לטווח ארוך.
שיטת בחירה לחקירת קישוריות ארוכת טווח במעגלים עצביים היא השימוש בביטוי מתווך של וירוסים בתיווך. שימוש בזריקות vivo סיטקאיות כפי שמתואר כאן, ביטוי של ערוצי יונים מגודרת באור יכול להיות ממוקד ומוגבל לאזור המוח הרצוי. בדרך זו, מתקשרים הם יעילים למיפוי התקשרות מתוך מחוז אחד למטרה. מסופי מסופים מתוונים עשויים להיות ממריצים עם אור בהכנה לחיתוך המוח, והקלטות הדבקה מהדק כקריאה מאפשרת בדיקה של הפונקציות והעוצמות של רכיבי מעגל ספציפיים במוח8. הגישה האופגנטית בשילוב עם הזרקת סטריאוטקאית של וירוס מציעה ספציפיות ללא תקדים ושליטה גנטית9. גירוי באור מאפשר בנוסף לדיוק בזמן התיכון ומרחבית10,11.
Presubiculum הוא שישה שכבות מבנה קורטיקלית במעבר של ההיפוקמפוס ואת היווצרות פרה-היפוקמאל12,13. הוא מקבל קלט סינפטית חשוב מן ADN11 אבל גם מכמה אזורים אחרים קליפת המוח הקליפת המוח14. לפיכך, הגירוי הסלקטיבי של המסופים התאלתלמי בתוך פרוסה מפרה-משנית אינו אפשרי עם גירוי חשמלי ולא מגלוטמט הזדקנות. המתואר בפרוטוקול זה הם שיטות לקביעת קישוריות תפקודית בין אזורי המוח (ADN ו presubiculum) באמצעות זריקות סטריאוטקאית מדויקת של וקטורים ויראליות המבטא ערוצים מגודרת אור. כמו כן תיאר את הגירוי של מסופי אקסונים של הקרנת נוירונים באזור היעד שלהם, בשילוב עם הקלטות של תאים שלמים הקלטה-קלאמפ של נוירונים פוסט סינפטית בהכנה לחיתוך המוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
בהזרקה vivo נגיפית כדי לבטא opsins רגישים לאור באזור המוח המוגדר היא שיטת בחירה עבור הניתוח אלקטרואופטיקה של קישוריות ארוכת טווח פונקציונליות של10,11,17,18. זריקות סטריאוטקאיות מציעות את האפשרות למטרה מדויקת של אזור מסוים במוח…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ברטרנד Mathon, מארי נסאר, Li-Wen הואנג, ו ז’אן סימוננט לעזרתם בפיתוח גרסאות קודמות של פרוטוקול ההזרקה סטריאוטקאית ו מארין מנואל ו פטריס Jegouzo לעזרה טכנית. עבודה זו נתמכה על ידי המשרד הצרפתי לחינוך ומחקר (L. R., L. S.), המרכז הלאומי של אטיודים Spatiales (M. B.), ו-סוכנות הידיעות הלאומית דה לה רצ’רצ’ה גרנט Anr-18-CE92-0051-01 (ד. פ.).
Materials
| 0.5 mm bur | Harvard Apparatus | 724962 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton | 1701 RN – 7653-01 | |
| 10X PBS solution | Thermofisher Scientific | AM9624 | text |
| 36% PFA | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 470 nm LED | Cairn Research | P1105/470/LED DC/59022m | use with matched excitation filter 470/40x and emission filter for GFP |
| AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 |
| All chemicals | Sigma | ||
| Bath temperature controler | Luigs & Neumann | SM7 | Set at 34°C |
| beveled metal needle | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 13mm, point style 4-20° |
| Big scissors | Dahle Allround | 50038 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | final 1-3 mg/ml |
| Borosilicate Capillaries | Havard Apparatus | GC150-10 | 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter |
| Brown Flaming electrode puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| BupH Phosphate Buffered Saline pack | Thermofisher Scientific | 28372 | |
| butterfly needle for perfusion | Braun | Venofix A | 24G |
| CCD Camera | Andor | DL-604M | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | 20X |
| curved forceps | FST | 11011-17 | |
| CY5 configuration (confocal) | Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 | ||
| CY5 configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DAPI configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60) | |
| Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
| Digital handheld optical meter | ThorLabs | PM100D | Parametered on 475 nm |
| Double egde stainless steel razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Use half of the blade in the slicer |
| Dual Fluorescent Protein Flashlight | Nightsea | DFP-1 | excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass. |
| EGTA | Sigma | E4368 | final 0,2 mM |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 or 20X |
| Filter paper | Whatman | ||
| Fluoro-Ruby 10% | Millipore | AG335 | disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl |
| GFP configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555) | |
| Heatingplate | Physitemp | HP4M | |
| Heparin choay 5000 U.I./ml | Sanofi | 5 ml vial | |
| HEPES | Sigma | H3375 | final 10 mM |
| High speed rotary micromotor kit | Foredom | K.1070 | maximum drill speed 38,000 rpm |
| Internal solution compounds : | |||
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| KCl | Sigma | P4504 | final 1,2 mM |
| Ketamine 1000 | Virbac | ||
| Ketofen 10% | Merial | 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%) | |
| Laocaine (lidocaine) | MSD | 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%) | |
| LED hi power spot for surgery | Photonic (via Phymep) | 10044 | |
| LED Power Supply | Cairn Research | OptoLED Light Source | |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-7 | |
| Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | final 4 mM |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | final 2 mM |
| Micro temperature controler | Physitemp | MTC-1 | |
| Milk powder | Carnation | ||
| MultiClamp 700B | Axon Instruments | ||
| Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | final 10 mM |
| Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | final 0.4 mM |
| needle holder/hemostat | FST | 13005-14 | |
| pClamp acquisition software | Axon Instruments | ||
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 on the display for 2-3 ml/min |
| Potassium gluconate (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
| ProLong Gold antifade mounting medium | Thermofisher Scientific | P36390 | |
| Rompun 2% (xylazine) | Bayer | ||
| small scissors | FST | 14060-09 | |
| Sodium chloride 0.9% | Virbac | dilute 8.5 mL in 10 ml total | |
| Stereomicroscope VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
| Stereotaxic frame with digital display | Kopf | Model 940 | Small animal stereotaxic instrument |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Life technologies | 434315 | |
| Streptavidin-Cy5 conjugate | Thermofisher Scientific | S32357 | |
| Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g tube |
| Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid | Ethicon | F3210 | |
| Syringe pump | kdScientific | Legato 130 – 788130 | Use Infuse and Withdraw modes |
| Tissue slicer | Leica | VT1200S | speed 0.07, amplitude 1. |
| tubing | Gilson | F117942, F117946 | Yellow/Black, Purple/Black |
| upright microscope | Olympus | BX51W1 | |
| Versi-dry bench absorbant paper | Nalgene |
Referências
- Goodridge, J. P., Taube, J. S. Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).
- Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal. Science. 347 (6224), 870-874 (2015).
- Fan, Y., et al. Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h). Nature Neuroscience. 8 (11), 1542-1551 (2005).
- Takahashi, H., Magee, J. C. Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons. Neuron. 62 (1), 102-111 (2009).
- Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat. Brain Structure & Function. 222 (5), 2421-2438 (2017).
- Callaway, E. M., Yuste, R. Stimulating neurons with light. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 587-592 (2002).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, 2 (2009).
- Mao, T., et al. Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex. Neuron. 72 (1), 111-123 (2011).
- Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nature Protocols. 5 (3), 439-456 (2010).
- Simonnet, J., et al. Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum. Nature Communications. 8, 16032 (2017).
- Nassar, M., et al. Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 38 (28), 6411-6425 (2018).
- Fricker, D., et al. Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current. The Journal of Physiology. 587, 4249-4264 (2009).
- Simonnet, J., Eugène, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. Cellular neuroanatomy of rat presubiculum. The European Journal of Neuroscience. 37 (4), 583-597 (2013).
- Simonnet, J., Fricker, D. Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system. Cell and Tissue Research. 373 (3), 541-556 (2018).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).
- Huang, L. -. W., et al. Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex. eNeuro. 4 (2), (2017).
- Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 34 (50), 16739-16743 (2014).
- Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neuroscience Bulletin. 31 (6), 685-696 (2015).
- Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Hass, C. A., Glickfeld, L. L. High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2056-2066 (2016).
