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14NH4+/15NH4+ N2O로순차적변환을 통한 분석 에 따른 암모늄에 대한 질산염 감소의 잠재적 비율 측정

Published: October 07, 2020
doi:
10.3791/59562
, , , , , ,
1Department of Biological Sciences, Faculty of Science and Engineering,Chuo University, 2Faculty & Graduate School of Urban Environmental Sciences,Tokyo Metropolitan University, 3Center for Ecological Research,Kyoto University, 4Department of Chemistry, Faculty of Science,Toho University, 5Graduate School of Integrated Arts and Sciences,Hiroshima University

Summary

14NH4+15NH4+분석을 기반으로 잠재적 DNRA 속도를 결정하는 일련의 방법이 자세히 제공됩니다.+ NH4+ 여러 단계를 통해 N2O로 변환하고 쿼드러폴 가스 크로마토그래피 – 질량 분석법을 사용하여 분석된다.

Abstract

지상파에서 수생 생태계로 옮겨지는 지배적N종인 질산염(NO33−)의운명을 이해하는 것의 중요성은 산업화 이후 글로벌 질소 하중이 급격히 증가했기 때문에 증가하고 있다. 암모늄 (DNRA)과 탈질화에 대한 실질암염 감소는 호흡을 위해 NO3– NO3를 사용하는 미생물 과정입니다. 탈질에 비해 DNRA 활동의 정량적 결정은 제한된 범위까지만 수행되었습니다. 이것은 NO3에서DNRA의 중요성에 대한 이해가 충분하지 않은 것으로이어졌습니다 – 변환 및이 프로세스의 조절 요인. 이 논문의 목적은 환경 샘플에서 잠재적 DNRA 속도를 측정하기 위한 자세한 절차를 제공하는 것입니다. 간단히 말해서, 잠재적 DNRA 속도는 15 N 라벨 암모늄(15NH4+) 축적 속도15NO3– 추가 인큐베이션에서 계산 될 수있다. 15 본 논문에 기재된 14NH4+ 및 15NH4+ 농도의 결정은 다음 단계로 구성된다. 첫째, 샘플내의NH4+는 암모늄 염으로서 산성유리 필터에 추출및 갇혀 있다. 둘째, 갇힌 암모늄은 영출되어 NO3로산화됩니다– persulfate 산화를 통해. 셋째, NO3– N2O 환원 효소 결핍 된 탈모를 통해 N2O로 변환됩니다. 마지막으로, 변환된N2O는 이전에 개발된 쿼드러폴 가스 크로마토그래피-질량 분광법 시스템을 사용하여 분석된다. 우리는 소금 습지 퇴적물에이 방법을 적용하고 제안 된 절차가 이전에 설명 된 방법에 비해 간단하고 빠른 결정을 허용한다는 것을 보여 줌, 자신의 잠재적 인 DNRA 속도를 계산했다.

Introduction

질소 비료의 인공 합성 및 광범위한 응용 프로그램은 크게 글로벌 질소 주기를 혼란. 산업 이전1회이후 지상파에서 연안 시스템으로의 반응성 질소 전송이 두 배로 증가한 것으로 추정된다. 주어진 필드에 적용 된 비료의 상당 부분은 주로 NO3– 2로,강이나 지하수에 토양에서 멀리 세척된다. 이것은 식수 오염, 부영양화 및 저산소증의 형성과 같은 환경 문제를 일으키는 원인이 될 수 있습니다. NO3– 물 환경에서 생물학적 동화 및 다양한 미생물 경화 과정을 통해 생태계에서 제거되거나 유지됩니다. 탈질 및 anammox는 NO3에대한 주요 미생물 제거 과정으로 알려져있습니다 –. 탈옥은 NO3의미생물 감소-기체 N 제품 (NO, N2O 및 N2)유기 물질과 같은 전자 기증자의 산화와 결합하여 위에서 언급 한 문제의 위험을 감소시킵니다. Anammox는 또한 NO2에서N2를 생산하고– NH4+; 따라서 생태계에서 무기 N을 제거합니다. 반대로 DNRA는 생태계에서 N을 유지하기 위해 노력합니다. DNRA는 주로 발효 박테리아 또는 chemolithototrophic 박테리아에 의해 수행 되며 그들은 dissimilatory NO3을감소 허용– 생체 이용 및 덜 모바일 NH4+.

DNRA에 대한 연구는 주로 해양 또는 에스투아린 퇴적물과 물, 소금 또는 진부한 습지 토양 및 맹그로브 토양과 같은 해양 또는 에스투아린 생태계에서 수행되었습니다. 해안 또는 해양 생태계는 NO,,3– 지상 생태계에서,제거하기위한 저수지로서 중요하며, 이전 연구에서 DNRA는 NO3,– 제거 (0-99%),3,,4,,5,6,6,7,9,10,11,,912,,13,,14,15,,16, 16,,17,18을매우 넓은 범위에 걸쳐 기여하는 것으로 나타났습니다. 또한,민물환경(19),논토양20, 산림토양(21)등 다양한 환경에서 DNRA의 존재가 입증되고 있다.21 이러한 연구는 DNRA가 잠재적으로 NO3에대한 탈결에 필적하는 것으로 나타났습니다동안 – 제거, DNRA 활동을 측정하는 연구는 여전히 매우 제한되는 그 측정 탈질에 비해.

DNRA 속도는 분석 또는 수치 모델을 통한 데이터 분석과 함께 15개의N 라벨링 기술을 사용하여 평가되었습니다. DNRA 속도를 계산하는 하나의 분석 용액은 15NO3-를 추가 한 후 NH4+ 풀의 15N 농축의 증가를 기반으로 – 트레이서로. 15 N-labeled NO3– 샘플에 첨가되고 배양되고, DNRA 속도는 NH4+의 농도 및 동위원소 비율 변화로부터 일정 기간 전후로 계산될 수 있다. 본 논문에서, DNRA 속도를 계산하는 데 필요한 NH4++ 농도 및 동위원소 비율을 정량화하는 방법이 자세히 설명된다. 기본적으로, 여기에 보고된 방법은 이전에 보고된 여러 기술의조합으로, 22,,23,,24,,25,,26은 일부 절차에 추가된 수정을 한다. 이 방법은 5개의 분대 절차의 시리즈로 구성됩니다: (1) 안정된 동위원소 추적기의 개정과 환경 샘플의 인큐베이션, 153− NO3−, (2) 수정과 함께 “확산 절차”를 사용하여4NH4+ 의 추출 및4회수, (3) NH 4 15+ 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 154+ 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + 15 + DNR의− 성분 절차로 구성됩니다. NO3– 및 15NO3–(4) NO 3– 15및 15NO+ 33– 수정 된 탈질법을 통해 N2O 이소 토포머에, (5) 가스 크로마토그래피 – 질량 분광법 (GC / MS)을 사용하여 N2O 이소토포머의 정량화. 다음 섹션에서는, 먼저, 프로시저(2) 및 (4)에 대한 준비가 설명되고, 그 후, 5개의 구성 요소 절차가 모두 상세히 설명된다.

Protocol

1. 기체 NH3를 정량적으로 포획하기 위한 PTFE 봉투 준비 알루미늄 호일의 작은 시트 (약 300mm x 450mm 크기, 에탄올로 닦아)의 작은 시트에 폴리테 트라플루오로틸렌 (PTFE) 테이프 (폭 25mm)의 60mm 조각을 놓습니다. 머플 로에서 450°C에서 유리 섬유 필터(직경 2.7 μm의 직경 10mm)를 450°C로 재처리합니다. 테이프의 긴 축의 중간점 위에 유리 섬유 필터를 조금 놓습니다(도<strong class="xfig"…

Representative Results

이 논문에 제시된 대표적인 결과는 염습지 퇴적물의 15N추적 실험에서 유래하였다. 일본 미야기현 케센누마시 무네 지역에서 2011년 동일본 대지진의 여파로 샘플링된 소금 습지가 새로 만들어졌습니다. 2017년 9월, 하조 와 조간 구역의 두 곳에서 표면 퇴적물(0-3cm)이 수집되었습니다. 첫째, 수집 직후, 퇴적물을 4mm 메쉬를 통해 체질되어 식물 뿌리, 껍질 파편 및 잔해…

Discussion

DNRA 분석을 위한 NH44+의 농도 및 동위원소 비율은 여러 가지 방법을 사용하여 정량화되었다. NH4+의 농도 및 동위원소 비율은 일반적으로 별도로 측정됩니다. NH4++ 농도는 전형적으로 자동분석기4,10,,15,,,16,,17을포함하는 색법 ?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

데이터 수집 및 프로토콜 개발을 도와주신 다나카 나오토에게 감사드립니다. 샘플 컬렉션은 JSPS KAKENHI 그랜트 넘버 17K15286에 의해 지원되었다.

Materials

15N-KNO3 SHOKO SCIENCE N15-0197
15N-NH4Cl SHOKO SCIENCE N15-0034
20 mL PP bottle SANPLATEC 61-3210-18 Wide-mouth
Aluminum cap Maruemu 1307-13 No. 20, with hole
Boric acid Wako 021-02195
Centrifuge HITACHI Himac CR21G II
Deoxygenized Gas Pressure & Replace Injector SANSIN INDUSTRIAL IP-12
Disposable cellulose acetate membrane filter ADVANTEC 25CS020AS Pore size 0.22 µm, 25 mm in diameter
Disposable syringe Termo SS-10SZ 10 mL
Disposable syringe Termo SS-01T 1 mL
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (-) NISSUI PHARMACEUTICAL 5913
Gastight syringe VICI Valco Instruments 4075-15010 Series A-2, 100 µL
GC/MS shimadzu GCMS-QP2010ultra
GF/D Whatman 1823-010 10 mm in diameter
Glass vial Maruemu 0501-06 20 mL
Gray butyl rubber stopper Maruemu 1306-03 No.20-S
H2SO4 Wako 192-04696 Guaranteed Reagent
K2S2O8 Wako 169-11891 Nitrogen and Phosphorus analysis grade
KCl Wako 163-03545 Guaranteed Reagent
KNO3 Wako 160-04035 Guaranteed Reagent
NaOH Wako 191-08625 Nitrogen compounds analysis grade
NH4Cl Wako 017-02995 Guaranteed Reagent
Plastic centrifuge tube ASONE 1-3500-22 50 mL, VIO-50BN
Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens American Type Culture Collection (ATCC) ATCC 13985 Freeze-dried, the type strain of Pseudomonas aureofaciens
PTFE sealing tape Sigma-Aldrich Z221880 25 mm in width
Reciprocating shaker TAITEC 0000207-000 NR-10
Screw-cap test tube IWAKI 84-0252 11 mL
PTFE-lined cap for test tube IWAKI 84-0262
Tryptic Soy Broth Difco Laboratories 211825
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Referências

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Kuroiwa, M., Fukushima, K., Hashimoto, K., Senga, Y., Sato, T., Katsuyama, C., Suwa, Y. Measurement of the Potential Rates of Dissimilatory Nitrate Reduction to Ammonium Based on 14NH4+/15NH4+ Analyses via Sequential Conversion to N2O. J. Vis. Exp. (164), e59562, doi:10.3791/59562 (2020).
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