Aqui nós apresentamos um protocolo, projetado usar ferramentas chemogenetic para manipular a atividade de progenitores corticais do interneurônios transplantados no córtice de ratos pós-natal adiantados.
O desenvolvimento neuronal é regulado por uma combinação complexa de fatores ambientais e genéticos. Avaliar a contribuição relativa de cada componente é uma tarefa complicada, o que é particularmente difícil no que diz respeito ao desenvolvimento de interneurônios corticais (GABA) ergálicos de ácido γ-aminobutírico. Os CIs são os principais neurônios inibitórios no córtex cerebral, e desempenham papéis-chave em redes neuronais, regulando tanto a atividade de neurônios piramidais individuais, como também o comportamento oscilatório de conjuntos neuronais. Eles são gerados em estruturas embrionárias transitórias (Eminências gangliônicas medial e caudal-MGE e CGE) que são muito difíceis de direcionar eficientemente usando abordagens de eletroporação de Utero. Os progenitores de interneuron migram distâncias longas durante o desenvolvimento embrionário normal, antes que se integrem no circuito cortical. Esta notável capacidade de dispersão e integração em uma rede em desenvolvimento pode ser seqüestrado por transplante de precursores embrionário do interneurônios em córtices de acolhimento pós-natal precoce. Aqui, nós apresentamos um protocolo que permita a modificação genética de progenitores embrionário do interneurônios usando o electroporation ex vivo focal. Estes precursores projetados do interneurônios são transplantados então em córtices adiantados do anfitrião do borne-Natal, onde matarão em cis fàcilmente identificáveis. Este protocolo permite o uso de múltiplas ferramentas geneticamente codificadas, ou a capacidade de regular a expressão de genes específicos em progenitores do interneurônios, a fim de investigar o impacto de variáveis genéticas ou ambientais sobre a maturação e integração dos CIs.
A função das redes neuronais depende da existência de um complemento equilibrado de neurônios de projeção excitatórios e interneurônios inibidores. Embora os interneurônios corticais (CIS) representem somente 20% de todos os neurônios nos córtices de mamíferos, os deficits em seu número ou função são pensados para jogar uma parte chave na patogénese de desordens do neurodesenvolvimento1,2. O estudo do desenvolvimento do CI é desafiador porque os CIS são gerados em estruturas embrionárias transientes que são difíceis de alcançar, e seguem uma migração tangencial longa antes que alcancem o pálio e desenvolvam seu maduro anatômico e physiological Propriedades3. Os mecanismos genéticos e ambientais são conhecidos que regulam o desenvolvimento do CI4, mas provou difícil estudar a contribuição relativa de fatores múltiplos.
Muitas percepções no desenvolvimento do CI foram obtidas usando sistemas in vitro da cultura após o isolamento dos progenitores das Eminências ganglionic5,6. Uma das grandes vantagens desses métodos é o potencial de rotular e modificar geneticamente os progenitores isolados e seguir sua diferenciação em detalhes, para detectar mudanças celulares-autônomas. No entanto, esses métodos não conseguem oferecer informações sobre as interações entre o desenvolvimento de interneurônios e uma rede ativa. Nós adaptamos estes protocolos, pela transplantação dos precursores modificados no córtice borne-Natal adiantado. Os progenitores do interneuron isolados das Eminências ganglionic embrionário podem sobreviver, dispersar e integrar na rede do anfitrião em cima da transplantação no córtice7,8. Este método tem sido utilizado para reduzir a severidade das crises epilépticas em modelos genéticos de camundongo, e tem sido proposto como uma possível nova terapia para diferentes distúrbios do neurodesenvolvimento9,10. Um protocolo precedente descreve um procedimento para transduce estes precursores com vetores virais antes dos transplantações11. O protocolo que descrevemos aqui também permite a modificação genética de interneurônios, mas não requer a criação de um vetor viral, exigindo apenas DNA plasmídeo, o que aumenta consideravelmente a sua flexibilidade. Alguns estudos relataram sucesso na utilização de eletroporação em utero para modificar geneticamente os progenitores do interneurônios nas Eminências gangliónicas caudais (CGE)12, mas este método provou ser muito difícil de reproduzir.
Na seção de resultados representativos, ilustramos o uso deste método para expressar receptores de designers exclusivamente ativados por drogas de grife (DREADDs13) nos cis transplantados, um método que usamos em uma publicação recente14. Nós expressamos hM3D (GQ), um receptor projetado baseado no receptor colinérgicos humano CHRM3, que não afeta a função neuronal a menos que liga seu ligante específico Clozapine-N-óxido (CNO). A administração de CNO seletivamente dispara a ativação de hM3D (GQ) expressando pilhas. Nós usamos este método para mostrar que a despolarização autônoma e transiente da pilha é suficiente para impedir o apoptose dos CI durante o desenvolvimento14. Combinado com as ferramentas genetically codificadas diferentes, este protocolo tem o potencial para acima-ou para baixo-regula a expressão de Gene, e visualiza ou manipula a atividade da pilha durante estágios diferentes da diferenciação do interneurônios.
Aqui nós descrevemos uma metodologia extensamente acessível para modificar genetically a atividade de precursores do CI para estudar o impacto da atividade intrínseca na maturação do CI, e/ou o efeito da atividade modulada CIs na montagem/função do cortical integrado Circuitos.
No passado, vários laboratórios, incluindo o nosso, tinham realizado em experimentos de eletroporação utero, a fim de modificar geneticamente os neurônios de projeção6. Entretanto, no utero o electroporation em Eminências ganglionic que incluem progenitores do CI é muito difícil, devido aos problemas elétricos do trajeto da condução. A fim resolver este problema, um número pequeno de laboratórios está realizando injeções guiadas do ultra-som seguidas pelo Electroporation, que é uma técnica de exigência que exija o equipamento caro. Este protocolo fornece uma alternativa a estas metodologias que é acessível à maioria da comunidade científica.
Um dos aspectos mais desafiadores deste protocolo é maximizar o número de células que sobrevivem no córtex hospedeiro para estágios maduros, quando a análise fenotípica é geralmente realizada (muito dependente do experimento, mas tipicamente mais velho que P17). Há três etapas chaves que o investigador deve prestar atenção: (1) a eficiência do Electroporation. Isto pode ser maximizado assegurando a pureza de Plasmids do ADN. Somente os plasmíos de DNA de alta qualidade (uma relação de A260/a280 de 1.9-2.0) devem ser usados para este procedimento. Nós obtemos tais preparações de alta qualidade do ADN empregando a purificação do ADN do cloreto do césio. Outro fator crucial é o promotor que impulsiona a expressão do gene de interesse. Descobrimos que o vetor pCAGGs, que consiste no promotor de frango b-actina, é extremamente poderoso e pode aumentar drasticamente a eficiência de eletroporação. (2) o número de embriões Doadores iniciais. É importante certificar-se de que um grande número (12-16) de embriões da mesma fase é electroporated. Esse número pode ser aumentado, se mais experimentadores estiverem realizando dissecções embrionárias e seccionando juntas, pois é importante que as fatias corticais embriônicas sejam obtidas, eletroporadas e transferidas para a incubadora o mais rápido possível. (3) é importante certificar-se de que um grande número de pilhas está injetada em cada filhote de cachorro para assegurar uma possibilidade elevada de sobrevivência transplantada da pilha até estágios maduros. Além disso, isso melhorará drasticamente a probabilidade de transplantes bem-sucedidos, uma vez que as preparações celulares de baixa densidade resultarão na mistura desigual das células com o meio, o que produzirá variabilidade significativa nos cérebros transplantados15 .
O protocolo aqui descrito foi adaptado para investigar o papel da atividade na regulação da sobrevida do CI de forma autônoma de células. A janela de tempo de P14-P17 para realizar as injeções de CNO foi escolhida especificamente de acordo com dados publicados, que mostram que o pico da morte celular dos progenitors transplantados do CI ocorre durante este período16. Portanto, este período de tempo ou a frequência de injeções de CNO podem não ser verdadeiras para outros tipos de células ou regiões cerebrais, e o investigador deve ajustar esses parâmetros de acordo com as finalidades experimentais específicas. Finalmente, a metodologia descrita aqui para as injeções intracranial dos CIS é somente praticável para filhotes P0-P5 (dependendo também do fundo da linha do rato). Em princípio, qualquer injeções sobre P5 exigirá desbaste ou remoção do crânio15.
Uma das principais vantagens deste protocolo é a capacidade de usar novas ferramentas geneticamente codificadas para visualizar ou manipular a atividade dos CIs durante diferentes estágios de diferenciação à medida que eles se integram em uma rede em desenvolvimento. Com o ritmo de descoberta de novos sensores de tensão e cálcio geneticamente codificados, bem como novas ferramentas quimiogenéticas e optogenéticas, este protocolo permite que os pesquisadores os usem dentro de semanas de lançamento em repositórios de plasmídeo, como o Addgene.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por uma concessão do acionador de partida de ERC (282047), um prêmio do investigador da confiança de Wellcome (095589/Z/11/Z), uma concessão do desejo do EC do FP7, e um prêmio do Instituto do Lister a JB. O trabalho no laboratório do vice-presidente é apoiado pelo BBSRC (BB/L022974/1), pelo Conselho de pesquisa médica do Reino Unido (MRC), e pelo Instituto Francis Crick (que recebe financiamento do MRC, pesquisa do câncer do Reino Unido e do Wellcome Trust). A pesquisa em laboratório M.D. foi possível através da concessão da Fundação Stavros Niarchos para o B.S.R.C. “Alexander Fleming”, como parte da iniciativa da Fundação para apoiar a pesquisa grega.
Medium/Supplements | |||
B-27 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 175040-044 | |
DMEM/F12 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21331-020 | |
DNAse | SIGMA | DN15-100MG | |
FBS | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 10270-098 | |
100x Glutamine | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 35050-061 | |
L15 | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 11415-049 | |
MEM alpha, GlutaMAX | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 32561-029 | |
Neurobasal medium | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 21103-049 | Neuron basic medium |
100x P/S | GIBCO (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | |
Equipment | |||
Electroporator | BTX | ECM 830 generator | |
Injector for acute slice electroporation | Eppendorf | FemtoJet Microinjector | |
Injector for cell transplantation (I) | Visual Sonics | Vevo Injector System | |
Injector for cell transplantation (II) | WPI | NANOLITER2010 | |
Magnetic Stand | WPI | M10L Magnetic Stand | |
Kite Manual Micromanipulator | WPI | KITE-M3-R | |
Platinum Elecrode (I) | Protech International Inc. | CUY-700-1 | |
Platinum Elecrode (II) | Protech International Inc. | CUY-700-2 | |
Steel Base Plate | WPI | 5479 | |
Vibratome | Leica | VT1200S | |
Other Material | |||
Glass capillaries for electroporation | VWR | 1B100-4 | |
Glass capillaries for cell transplantation | Visual Sonics | provided by Visual Sonics | |
Nuclepore 8 µm whatman membrane | SLS | 110414 | |
Organ tissue culture dishes | BD Biosciences (Falcon) | 353037 |