Hög genomströmning DNA plasmid Multiplexing och transfektion med akustisk Nanodispenseringsteknik

Summary

Detta protokoll beskriver hög genomströmning plasmid transfektion av däggdjursceller i en 384-brunn plattan med hjälp av akustisk dropp ejektion teknik. Den tidskrävande, felbenägna DNA dispensering och Multiplexing, men också transfection reagens dispensering, är programvara driven och utförs av en nanodispenser enhet. Cellerna är sedan seedade i dessa förfyllda brunnar.

Abstract

Cell transfektion, oumbärlig för många biologiska studier, kräver att kontrollera många parametrar för en korrekt och framgångsrik prestation. Oftast utförs vid låga genomströmning, är det dessutom tidskrävande och felbenägna, ännu mer så när Multiplexing flera plasmider. Vi utvecklade en enkel, snabb och noggrann metod för att utföra cell transfektion i en 384-well tallrik layout med akustisk dropp ejektionsfraktion (ade) teknik. Den nanodispenseringsenhet som används i denna studie är baserad på denna teknik och möjliggör exakt nanovolymleverans med hög hastighet från en källbrunn plattan till en destination en. Det kan dispensera och multiplex DNA och transfektion reagens enligt en färdigdesignad kalkylblad. Här presenterar vi ett optimalt protokoll för att utföra ADE-baserade hög genomströmning plasmid transfektion som gör det möjligt att nå en effektivitet på upp till 90% och en nästan 100% cotransfection i cotransfection experiment. Vi utökar det initiala arbetet genom att föreslå ett användarvänligt kalkylbladsbaserat makro, som kan hantera upp till fyra plasmider/brunnar från ett bibliotek som innehåller upp till 1 536 olika plasmider, och en tablett-baserad pipettering guide ansökan. Makrot utformar den eller de nödvändiga mallen (-erna) på käll plattan (-erna) och genererar färdiga filer för nanodispensern och tablettbaserade program. De fyra stegen transfektion protokollet innebär i) en spädningsvätska avstå från en klassisk flytande handler, II) plasmid distribution och Multiplexing, III) en transfektion reagens dispensering av nanodispenser, och IV) cellplätering på de förfyllda brunnarna. Den beskrivna mjukvarubaserad kontroll av ADE plasmid Multiplexing och transfektion tillåter även icke-specialister inom området för att utföra en tillförlitlig cell transfektion på ett snabbt och säkert sätt. Den här metoden möjliggör snabb identifiering av optimala inställningar för en given celltyp och kan överföras till högre skala och manuella metoder. Protokollet underlättar tillämpningar, såsom human ORFeome protein (uppsättning av öppna läsramar [ORFs] i ett genom) uttryck eller CRISPR-Cas9-baserad genfunktion validering, i nonpoolade screening strategier.

Introduction

Den metod som presenteras här beskriver i detalj hur man utför DNA plasmid Multiplexing och transfektion i däggdjursceller vid hög genomströmning med hjälp av en akustisk-baserade flytande nanodispenser i en 384-bra tallrik, även för icke-specialister inom området. Detta nyligen publicerad metod¹ gör det möjligt att utföra så mycket som 384 oberoende PLASMID DNA Multiplexing och transfektion villkor i ett experiment, på mindre än 1 h. enstaka eller cotransfektion experiment var framgångsrika, når en nära 100% transfektion inom den överförda cellpopulationen. Detta protokoll gör transfection lättare eftersom de flesta av de tråkiga, tidskrävande och felbenägna steg är nu programvara driven (se figur 1 för en allmän översikt). Ytterligare ansträngningar har gjorts för att utveckla dedikerade verktyg för att förbättra användarvänlighet och samtidigt undvika mänskliga fel under den övergripande processen och att främja framgångsrika transfektion även för icke-specialister inom området. Den beskrev protokoll omfattar en “förbrukaren-vänlig” makro Spreadsheet så pass vi vecklat upp for att hantera 384 oberoende transfektion författningarna med Multiplexing möjlighet av upp till fyra plasmider i var brunn. Makrot genererar automatiskt mallar av käll plattan (s) för att ladda den förväntade DNA plasmid volymen från att starta lagerlösningar och de filer som krävs för att driva nanodispensern programvara på experimentell design som har matas in. Eftersom manuell dispensering av DNA i en 384-well käll plattan är långtråkig och felbenägna, utvecklade vi också en dedikerad tablett-baserad applikation för att vägleda användaren medan dispensering DNA-lösning enligt mallen.

Figur 1: experimentellt arbetsflöde. Schematisk representation av den optimala automatiserade hög genomströmningen omvänd transfection protokoll (från experimentell design till anpassad biologisk analys). Manuella steg indikeras av hand symbolen och Ungefärlig tid för varje steg skrivs i en röd ruta. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Många cell-baserade experiment börjar med plasmid DNA-transfektion, och även om många dedikerade reagenser har varit och fortfarande utvecklas för att öka transfektion effektivitet och/eller underlätta förfarandet, mycket återstår att göra^{2,3 , 4}. DNA-plasmid cell transfektion innebär flera steg för att nå hög effektivitet, såsom ett initialt komplext upptag, endosomala flykt, och cytoplasmiska transport till Nucleus^5,6. Förutom kalcium nederbörd eller fysiska tekniker såsom elektroporation eller mikroinjektion med hjälp av dedikerade enheter⁷, moderna kemiska metoder har fokuserat på att förbättra DNA-cellleverans samtidigt sänka cell cytoxicitet^{8, 9}. Användningen av lipider eller katjoniska polymerer bildar liposomer-liknande komplex och, mer nyligen, nonliposomal polymera kemisystem har gjort transfektion enklare och effektivare¹⁰. Trots denna utveckling, cell transfektion kräver fortfarande specifika färdigheter som skall utföras korrekt som de flesta av dessa fysiska eller kemiska transfektion protokoll kräver forskare att manuellt förbereda varje DNA transfektion reaktions tillstånd, vilket försämrar dataflödet. För att kringgå detta problem har omvända transfektion protokoll utvecklats med hjälp av kemiska transfektion reagens^11,12,13, så att användaren kan testa eller kombinera flera plasmider på ett snabbare sätt. I dessa protokoll bildas nukleinsyrafkomplexen med transfektionsmedel innan de sådd cellerna på komplexen. Dessa omvända protokoll begränsas dock fortfarande av den manuella hanteringen av DNA-lösningar och av kombinationen av var och en av de oberoende förhållandena. Även om det är möjligt att utföra dem i en 96-bra plåtformat, DNA-förberedelse och dispenserar kommer att vara långtråkig, och det kommer sannolikt att bli misstag. När olika mängder av flera DNA-plasmider krävs och multiplexade med varandra, cell transfektion blir ännu svårare att uppnå och mer tidskrävande, och mänskliga fel blir ganska oundvikligt. Skala upp till 384-well plattan format i en omvänd transfektion strategi, trots få multiplexade DNA transfektion villkor, blir en omöjlig utmaning på grund av följande skäl. i) DNA-mängderna, transfektionsreagens eller reaktions blandnings volymer som ska hanteras är lägre än 1 μL för varje brunn. II) multiplexering av plasmider för 384 oberoende förhållanden blir oerhört komplicerat. Leveransen i var och en av de 384 brunnar är också III) mycket tidskrävande och IV) felbenägna. I själva verket är det svårt att hantera den rätta lösningen i de förväntade brunnarna eftersom de låga volymerna som redan dispenseras inte tillåter visuell övervakning mellan de tomma och redan fyllda brunnarna. v) Slutligen finns det en hög risk för torkning av blandningen genom avdunstning innan cellerna tillsätts på grund av den tid som behövs för att utföra nödvändiga dispenseringssteg. Sammanfattnings faktorn, den begränsande faktor för att inrätta hög genomströmning DNA plasmid transfektion analyser verkar vara miniatyrisering av analysen, vilket innebär låg volym multiplexering och hantera som inte kan hanteras manuellt längre men är också knappast möjligt i en tillförlitligt sätt av klassiska peristatiska vätske hanterare.

Som ett bevis på svårigheter att automatisera sådana analyser och få hög genomströmning, endast ett fåtal försök att automatisera transfektion har publicerats hittills: en 96-väl plattan format med hjälp av en kommersiell vätskehantering enhet och kalciumfosfat nederbörd¹⁴ och, mer nyligen, en lipoplex reagens, och en mikroflödessystem chip möjliggör 280 oberoende transfektioner¹⁵ men kräver specialiserade färdigheter inom detta område. En annan metod, acoustophoresis, vilket möjliggör flytande levitation och leder till vätske manipulation och blandning, användes för att utföra DNA-transfektion i 24-till 96-väl platta format¹⁶. Även om möjligt, denna metod lider av en extremt låg genomströmning som blandning av celler med DNA-transfektion blandning kräver en 60 s inkubering för varje enskild punkt före seedning. Detta innebär en varaktighet på minst 96 min för en komplett 96-brunn plattan. Dessutom är detta protokoll långt ifrån att vara mottagliga för den totala biologer publik eftersom detta arbete utfördes med en egen konstruerad och tillverkad enhet som för närvarande inte finns på marknaden. Tvärtom, under de senaste åren, en lättanvänd programvara driven akustiska-baserade dispenseringsteknik har uppstått med nano dispenser enheter. Med hjälp av fokuserad akustisk energi, dessa enheter tillåter tätt kontrollerad utmatning av små vätskevolymer från 2,5 nL till 500 nL från en källa plattan till en destination en¹⁷. Denna teknik, som kallas akustisk dropp utmatning (ade), har många fördelar: det är helt automatiserad, kontaktlös, tipless, exakt, exakt, och mycket reproducerbara, och den har en hög genomströmning¹⁸. Först ägnas åt att leverera dimetylsulfoxid (DMSO) lösningar, har inställningarna förbättrats för att avstå vattenhaltiga buffertar¹⁹. Akustiska nanodispensers, sedan, verkar lämplig för omvänd cell transfektion protokoll och kan kringgå de flesta av de ovan nämnda manuella begränsningar. Eftersom inga plasmid-transfektionförsök tidigare beskrivits med denna teknik, utvärderade vi nyligen lämpligheten av en akustisk-baserade dispenseringssystem för att utföra omvänd cell transfektion.

Dra nytta av nanodispenser genomströmning och användarvänlighet, vi optimerat en omvänd transfection protokoll för HeLa celler genom att korstesta flera parametrar som kan påverka DNA-transfektion på en 384-väl, enda platta, nämligen den totala DNA-mängden och källans DNA-startkoncentration, spädnings volym, transfektionsreagens och antal spridda celler. Det framkallade protokollet kringtar de ovan beskrivna manuella begränsningarna av cell transfektion och presenterar flera fördelar jämfört med andra automatiserade transfektionförsök. Först är det miniatyriserade, vilket möjliggör kostnadseffektiv transfektion reagens genom att spara DNA plasmid preparat och transfektion reagens. För det andra är det mycket mer hög genomströmning och reproducerbara än den manuella protokoll (även för nybörjare), som transfektion av en hel 384-väl plattan kan uppnås på mindre än 1 h. Slutligen är det programvara driven, vilket gör det möjligt att kontrollera den dispenserade DNA-mängden och multiplexering av flera plasmider. Faktum är att tack vare nanodispensern programvara (tabell över material), kan användaren utarbeta en studieplan för att kontrollera de volymer som ska dispenseras från en definierad källa väl plattan till en destination en.

Det protokoll som presenteras här är främst avsett för dem som har tillgång till en nanodispenser och skulle vilja inrätta transfektion experiment vid hög genomströmning, men också för dem som vill snabbt optimera sina transfection parametrar för en given celltyp av tillämpa detta protokoll för att korstesta flera parametrar vid högt dataflöde. Vi har faktiskt visat att optimerade parametrar som identifierats med detta nanoskala-protokoll kan överföras till storskaliga och manuella transfektionsexperiment. Slutligen, eftersom det transfektionsreagens som används i detta protokoll tillåter DNA-eller siRNA-transfektion enligt tillverkaren, är protokollet också av intresse för dem som siktar på att utföra array-metoder för genöveruttryck eller knockdown. Destinations plattorna förifyllda med DNA kan bevaras upp till 7 dagar före användning i en transfektion test utan förlust av effekt, vilket är en annan fördel med följande protokoll för denna typ av ansökan.

Protocol

1. förberedelser på förhand Beredning av peristaltiska vätske hanterare programAnmärkning: för spädnings-och cell dispenseringsstegen i protokollet måste ett särskilt program förberedas med beaktande av utmatnings huvudets höjd till den använda plattan och steg avsikten. För steg 1 μL spädningsvätska, montera en 1 μL kassett och Förbered ett program med de inställningar som beskrivs i steg 1.1.1.1 och 1.1.1.2. Justera parametern flödeshastighet till <stro…

Representative Results

fIn för att avgöra om ADE-tekniken kan användas för en automatiserad omvänd transfektion protokoll, vi övervakade cell transfektion effektivitet genom fluorescens mikroskopi, med hjälp av en röd fluorescerande tdTomato uttrycker plasmid. Först siktade på att bestämma de bästa parametrarna för transfektion, var olika spädnings volymer och totala mängder av DNA korstestade. Spädnings volymen användes för att tillåta att DNA-dropparna, en gång dispenserades, spreds över …

Discussion

Etablering och optimering av en exakt hög genomströmning metod för en given cellinjer kräver forskare att följa några viktiga parametrar som beskrivs i det här avsnittet. Vi uppmuntrar starkt att börja med de rekommenderade värdena i hela protokollet eftersom dessa inställningar optimerade för HeLa celler också visat sig vara effektiva för HEK-celler. Men eftersom de bästa parametrarna kan bero på cellinjer och transfektion reagenser, optimala förhållanden kan definieras genom att variera cell nummer, sp…

Materials

384LDV Microplate	Labcyte	LP-0200
384-well Microplate μClear Black	Greiner	781906
Ampicilin	Sigma	A9393-5G	Selection antibiotic for bacteria transformed with ampicilin expressing vector
Android Tablet	Samsung	Galaxy Note 8	used to guide the user while the source plate manual dispense
Aniospray Surf 29	Anios	2421073	disinfectant to clean the MicroFlo head
Columbus software	Perkin Elmer		image analysis software
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate	Thermo Fisher Scientific	10566032	cell culture medium
Echo Cherry Pick 1.5.3 software	Labcyte		Software enabling ADE-based dispenses by the Echo550 device from a *.csv file; nanodispenser software
Echo550	Labcyte		ADE-based dispenser
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	16000044	to add in cell culture medium
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Sigma-Aldrich	HT501128-4L	to fix cell
HeLa cells	ATCC	HeLa (ATCC® CCL-2™)
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570	10 mg/mL Solution in Water
INCell Analyzer 6000	GE Healthcare	29043323	automated laser-based confocal imaging platform
LB medium	Thermoischer Scientific LB Broth Base (Lennox L Broth Base)®, powder	12780052	culture medium for bacteria growth
Lysis Buffer (A2)	Macherey-Nagel	740912.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
MicroFlo 10µL cassette	Biotek Instruments Inc	7170013	to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo 1μL cassette	Biotek Instruments Inc	7170012	to use with the Microflo Dispenser
MicroFlo Dispenser	Biotek Instruments Inc	7171000	peristaltic pump-based liquid handler device
Microvolume spectrophotometer	Denovix	DS-11 Spectrophotometer	Measure the DNA concentration of samples
mVenus plasmid	mVenus cDNA was cloned by enzymatic restriction digestion and ligation in Age1/BsrG1 sites of the tdTomato-N1 plasmid		Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: mVenus
Neutralization Buffer (A3)	Macherey-Nagel	740913.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
NucleoSpin Plasmid kit	Macherey-Nagel	740588.50	used to prepare plasmid from bacterial culture
Optimal-Modified Eagle Medium (Opti-MEM) Medium	Thermo Fisher Scientific	31985070
optional Wash bufferWash Buffer (A4)	Macherey-Nagel	740914.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
orbital shaker	incubated large capacity shaker	444-7084	Used to grow bacteria under gentle agitation and 37°C
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140122	10,000 U/mL
Phosphate-Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	10010001
Plasmid mini-columns	Macherey-Nagel	740499.250	Silica membrane mini-column to prepare plasmid from bacterial culture
Resuspension Buffer (A1)	Macherey-Nagel	740911.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
RNAse A	Macherey-Nagel	740505	Enzyme from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
tdTomato-N1 plasmid	Addgene	Plasmid #54642	Vector type: Mammalian Expression, Fusion Protein: tdTomato
TransIT-X2 Dynamic Delivery System	Mirus Bio	MIR 6000
Wash Buffer (AW)	Macherey-Nagel	740916.1	Buffer from the NucleoSpin Plasmid kit used to prepare plasmid from bacterial culture
3D printer	Creality	CR10S	used to print the plate adapter
Blender Software	https://www.blender.org/ Free software under GNU General Public License (GPL).	version 2.79b	used to design the plate adapter