В этой статье описывается протокол цитометрии на основе ФРЕт для количественной оценки самосборки белка в обоих клетках S. cerevisiae и HEK293T.
Белковая самосборка регулирует функцию белка и разобщает клеточные процессы в пространстве и времени. Современные методы его изучения страдают от низкой чувствительности, косвенного считывания, ограниченной пропускной связи и/или уровня населения, а не одноклеточного разрешения. Мы разработали единую методологию на основе цитометрии потока, которая устраняет все эти ограничения: Distributed Amphifluoric FRET или DAmFRET. DAmFRET обнаруживает и количественно определяет собственные сборки белка с помощью сенсибилизированных выбросов FRET in vivo, позволяет развертывать в модельных системах – от дрожжей до клеток человека, и достигает чувствительных, одноклеточных, высокопроизводительных считываний независимо от белка локализации или растворимости.
Анализы для изучения гомотипических белковых взаимодействий, или “самосборки”, важны, потому что олигомерное состояние и растворимость белков диктуют свою функцию. Протеом изобилует гомо-мультимерами1,2,3,4,в то время как относительно мало белков функционируют как мономеры. Белки могут также собираться аберранцией из-за стресса, возраста или неправильного регулирования, что приводит к патологическим изменениям в активности. Выявление факторов, модулированных такими событиями, или даже физического характера собраний, часто является исключительно сложной задачей.
Все большее число белков в настоящее время признается самосборки с внеочередной cooperativity и неопределенной стоихиометрии, в результате чего их demixing от других клеточных компонентов, как белковые фазы. Они принимают форму неупорядоченных конденсатов, таких как капли и гели, или высоко упорядоченных нитей, таких как амилоидные волокна. Конформационные колебания, связанные с последним, делают его первоначальное образование, илинуклеацию, по своей сути вероятностной на молекулярном уровне 5,6. Поскольку вероятность нуклеации масштабируется с объемом, образование таких сборок может быть очень стохасальнымв пространственных пределах живых клеток 7,8. На крайности стохастического разделения фазы ядер-ограниченной прионы, высоки приказали агрегаты протеина которые только редк nucleate самопроизвольно, но как только сформировано, шаблон их собственный рост indefinitely. Один из таких белков, известный как ASC, выполняет цифровой прион-подобный переключатель в деятельности врожденных иммунных клеток млекопитающих. Самосборка ASC является ядреным благодаря своему взаимодействию с конкретными белками, которые сами олигомеризированы при связывающих патогенных или связанных с опасностью молекулярных моделях. ASC сборки в свою очередь, нуклеат procaspase-1 для самостоятельной сборки и активации, что приводит к созреванию цитокинов и пироптоз клетки9,10. Область ASC ответственная для своей агрегата принадлежит к superfamily домена смерти, которая consist of над 100 членами в людском proteome. Несмотря на ключевую роль доменов смерти в врожденном иммунитете и запрограммированной смерти клеток, большинство из них до сих пор не охарактеризованы в отношении самосборки. Обнаружению и характеристике дополнительных белков с таким поведением будет значительно способствовать прямое одноклеточное считывание белковой самосборки.
Классические подходы биохимии белка для изучения самосборки белка, такие как хроматография и ультрацентрифугация, в значительной степени ограничены оценками уровня популяции. Однако неоднородность от клетки к клетке, обусловленная переходами фазсы с ограниченной нуклеацией, не может быть смоделирована с помощью этого уровня детализации. Одноклеточные подходы, основанные на флуоресценционной микроскопии, восстанавливают эту способность, но не имеют пропускной способности, необходимой для точной количественной оценки нуклеации или обнаружения редких сборок. Кроме того, растворимые самосборки, такие как большинство ферментов и доамилоидных олигомеров, слишком малы и подвижны, чтобы их можно было решить стандартной световой микроскопией. Они могут быть обнаружены с помощью более сложных подходов, таких как спектроскопия флуоресценции корреляции, но они очень ограничены в количестве клеток и пропускной их.
Непонахтровые анализы белковой сборки, такие как ФРЕТ и сплит-флюорофорная добавка, предлагают потенциальное решение этих проблем. Тем не менее, они, как правило, требуют использования двух различных конструкций, выражающих белок интереса сливается с дополнительными теги-донор и принимающий фторофоров в случае FRET. Это ставит под угрозу экспериментальную пропускную силу, а также снижает чувствительность из-за изменения клеток к клетке в относительных уровнях донора и принимающего. Чтобы обойти это, мы разработали анализ, который использует фотоконвертируемый флюорофор, mEos3.111, который позволяет одной конструкции, чтобы выразить как донора, так и принимая помеченных белка. Спектр выбросов непреобразованного mEos3.1 (GFP-подобный донор) достаточно перекрывается с возбужданием спектра фотопреобразованных mEos3.1 (dsRed-like acceptor), чтобы позволить FRET произойти, когда молекулы находятся в непосредственной близости (Lt;10 нм). Таким образом, подвергая клетки эмпирически определенной дозе 405 нм света, которая фотоконвертирует оптимальную долю общего mEos3.1 в форму приемного, мы достигаем последовательных и воспроизводимых относительных уровней донора и приемного через несколько образцов, уровня хрувыражения и экспериментов. Мы измеряем принимая фторесценции, когда возбужденных либо непосредственно с 561 нм света, или косвенно (по передаче энергии от донора) с 488 нм света (т.е. сенсибилизированных выбросов FRET). Мы сообщаем о созыве белка как о соотношении этих двух значений и термине it amphifluoric FRET или AmFRET.
Для того, чтобы рассчитать концентрацию белка по цитометрии потока, мы сначала вычисляем среднее интенсивность флуоресценции Spc42 помечены mEos3.1. Поскольку дрожжевые клетки содержат около 1000 молекул Spc42, мы затем вычисляем интенсивность флуоресценции одной флуоресцентной зеленой молекулы mEos3.1. Используя ровную фотоконверсию во всех клеточных концентрациях(рисунок 1E),мы затем соотвествуем общие значения флуоресценции mEos3.1 для всех интенсивностей принятия после фотоконверсии. Затем мы можем разделить общее количество родинок флуоресцентных белков на приблизительный цитозоликовый объем (как определяется с помощью цитометрии потока изображений) для получения общей цитозоличной концентрации белка интереса. Для точных расчетов, пожалуйста, смотрите оригинал рукописи8.
Выражая mEos3.1-слитого белка из 2 “плазмида в дрожжах, мы зондпримернов примерно тысячу раз диапазон концентрации белка в каждом образце8. Мы достигаем того же в клетках HEK293T в силу изменения поглощения плазмида во время трансфекции, и, следовательно, переменного номера копии.
В результате распределение AmFRET, или DAmFRET, для многих тысяч клеток показывает концентрацию-зависимость самосборки в цитозол для любого белка, интересуемого. В целом, DAmFRET представляет собой стимулирующую методологию для обнаружения и характеристики самосборки белка с беспрецедентным сочетанием чувствительности, пропускной их возможности и воспроизводимости.
При использовании цитометра изображений позволяет нам получать измерения концентрации белка in vivo, такие цитометры пока не доступны в большинстве научно-исследовательских институтов. Тем не менее, DAmFRET может работать даже в типичном цитометре неизображения, чтобы получить распределение белковой сборки по диапазону экспрессии белка.
DAmFRET является наиболее полным методом обнаружения белка самосборки in vivo. DAmFRET сочетает в себе прямое считывание гомотипических белково-белковых взаимодействий в широком диапазоне концентрации, с разрешением одной клетки и высокой пропускной стоимостью. Прямое считывание DAmFRET и тот факт, что сброшенные белки не требуют специфической субклеточной локализации или нерастворимых состояний, устраняют ложные срабатывания и распространяют его применимость на широкий спектр белков в их родных субклеточных местах. Примечательно, что, помечая органеллы флюорофорами, которые являются спектрально совместимыми с mEos3.1, такими как T-Sapphire и mCardinal, субклеточная локализация растворимых и собранных форм белков может быть определена наряду с DAmFRET.
Используя цитометр потока изображений, как описано здесь, требуется 8 ч, чтобы проанализировать 96-ну колодец пластины с примерно 20000 закрытых клеток на скважину. Тем не менее, мы также регулярно выполняем DAmFRET со стандартными (не-изображения) цитометрами, которые достигают гораздо более высокой пропускной всей (до 20 образцов в минуту). В самом деле, любой цитометр потока с пространственно отделены 488 и 561 нм лазеров, который свободен от артефактов усилителя журнала и имеет соответствующие ПМТ и фильтры для обнаружения донора, FRET, и приемсигналсигналов достаточно для выполнения DAmFRET. В настоящее время это увеличение пропускной записи происходит за счет информации о локализации и определения объема, так что самосборка должна быть проанализирована как функция экспрессии белка, а не концентрации. Это не проблема для качественного анализа. Кроме того, можно оценить цитозоликовый объем путем слияния спектрально различных фторофора эндогенного “домашнего хозяйства” белка, выражение которого плотно коррелирует с цитосолительным объемом.
Как мы продемонстрировали благодаря развертыванию DAmFRET как в дрожжах, так и в клетках млекопитающих, DAmFRET может быть легко адаптирован к различным системам экспрессии. Это позволяет самосборку белков изучать сява в их родных клеточных контекстах. Кроме того, он предлагает возможность сравнить сборку белка через широко расходятся модели клеточной культуры для изучения сохранения механизмов, которые регулируют самосборку белка.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Джеффа Ланге, Джея Унру, Цзяньчжэна Ву, Тарик Хана и Эллен Кеттер за их работу по развитию асссе. Эта работа была проделана для выполнения, в частности, требований к кандидатским диссертационным исследованиям для Т.С.К. и A.R.G. в качестве студентов, зарегистрированных в Открытом университете, Великобритания, и Институте медицинских исследований, США, соответственно. Дополнительную информацию, связанную с ассеиами, можно найти в https://doi.org/10.1016/j.molcel.2018.06.016. Исходные данные, лежащие в основе этой рукописи, можно получить из хранилища исходных данных Stowers в http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1372. Эта работа была профинансирована NIH директора ранней независимости премии DP5-OD009152, марта Dimes Фонд Грант No 5-FY17-32, и Stowers институт медицинских исследований.
Вклад автора следующим образом. Концептуализация: Т.С.К., С.В. и Р.Х.; Методология: Т.С.К., С.В., А.Р.Г., а. Б.; Следствие: С.В., Т.С.К.и А.Р.Г.; Формальный анализ: С.В., и Т.С.К.; Кураторирование данных: T.S.K.; Визуализация: Т.С.К., и С.В., Письмо (Оригинальный проект): С.В., и Т.С.К.; Дать (Обзор, Редактирование): R.H., S.V., и T.S.K.; и Приобретение финансирования: R.H.
96 Well Plate | Axygen | P96-450R-C-S | |
ASC 2-92 (mammalian plasmid) | rhm1.0095 | Available on request | |
ASC 2-92 (R41E) (mammalian plasmid) | rhm1.0096 | Available on request | |
ASC 2-92 (R41E) (yeast plasmid) | rhx2432 | Available on request | |
ASC 2-92 (yeast plasmid) | rhx2431 | Available on request | |
Centrifuge | Eppendorf | 5430R | "centrifuge" in text |
CSM -Ura | Sunrise Science Products | 1004-100 | |
Dextrose | EMD Millipore | DX0145-5 | |
DMEM | Gibco | 11966025 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | EDS-500G | |
FCS Express 6 | DeNovo | FCS Express 6 Flow | "flow cytometry software" in text |
Fetal Bovine Serum | VWR Life Science | 45001-108 | |
Flow Cytometer | BioRad | ZE5 | Non-imaging flow cytometer |
FUGENE HD | Promega | E2311 | "transfection reagent" in text |
Galactose | VWR Life Science | 0637-500g | |
HSPE1 (yeast plasmid) | rhx1531 | Available on request | |
Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ImageStream X Mark II | "imaging flow cytometer" in text |
Mammalian Cells | HEK293T | ||
mEos3.1 (mammalian plasmid) | rhm1 | Available on request | |
mEos3.1 (yeast plasmid) | rhx0935 | Available on request | |
optiMEM | Gibco | 31985062 | "reduced serum media" in text |
PBS | VWR Life Science | 45000-446 | |
PenStrep | Gibco | 15070063 | |
PFA | Sigma-Aldrich | P6148-1KG | |
Photoconversion Lamp | OmniCure | S1000 | |
Plasmid #54525 | Addgene | #54525 | "publicly available plasmid" in text |
Titramax 1000 Plate Shaker | Heidolph Instruments | 1000 | "plate shaker" in text |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
Yeast Strain | rhy1713 | Available on request- S288c (MATα lyp1Δ can1Δ::STE2pr_SpHIS5 his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 cln3Δ0::GAL1pr_WHI5_hphMX) |