Lentiviral vermittelte Gen-Silencing in humanem Pseudoislet in niedrigen Befestigungsplatten zubereitet

Summary

Ein Protokoll zur Erstellung genmodifizierter menschlicher Pseudoislets aus dispergierten menschlichen Inselzellen, die durch Lentivirus mit kurzer Haarnadel-RNA (shRNA) transduziert werden, wird vorgestellt. Dieses Protokoll verwendet leicht verfügbare Enzym- und Kulturgefäße, kann leicht durchgeführt werden und produziert genetisch veränderte menschliche Pseudoislets, die für funktionelle und morphologische Studien geeignet sind.

Abstract

Verschiedene genetische Werkzeuge stehen zur Verfügung, um Gene in Pankreasinseln von Nagetieren zu modulieren, um die Funktion von Inselgenen für die Diabetesforschung zu sezieren. Die von Nagetierinseln gewonnenen Daten werden jedoch aufgrund bekannter Unterschiede in der Inselstruktur und -funktion zwischen den Arten oft nicht vollständig auf menschlichen Inseln reproduziert oder sind auf sie anwendbar. Derzeit sind Techniken, die zur Verfügung stehen, um die Genexpression menschlicher Inseln zu manipulieren, sehr begrenzt. Die Einführung von Transgen entumlässt durch Adenovirus, Plasmid und Oligonukleotide in intakte Inseln und leidet häufig unter geringer Effizienz und hoher Toxizität. Eine geringe Effizienz ist besonders problematisch in Gendownregulationsstudien an intakten Inselchen, die eine hohe Effizienz erfordern. Es ist bekannt, dass enzymatisch dispergierte Inselzellen sich in kulturbildenden Sphäroiden, die als Pseudoislets bezeichnet werden, neu anaggregieren. Die größengesteuerte Reaggregation menschlicher Inselzellen erzeugt Pseudoislets, die die dynamische Insulinsekretion der ersten Phase nach längerer Kultur aufrechterhalten und ein Fenster zur effizienten Einführung von lentiviraler Kurzhaarnadel-RNA (shRNA) mit geringer Toxizität bieten. Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Herstellung menschlicher Pseudoislets nach lentiviraler Transduktion mit zwei handelsüblichen Mehrwellplatten beschrieben. Das Protokoll kann leicht durchgeführt werden und ermöglicht eine effiziente Downregulation von Genen und die Beurteilung der Dynamik der Insulinsekretion mit menschlichen Ischenzellen. So bieten menschliche Pseudoislets mit lentiviral vermittelter Genmodulation ein leistungsfähiges und vielseitiges Modell zur Beurteilung der Genfunktion in menschlichen Inselzellen.

Introduction

Der Verlust der funktionellen Beta-Zellmasse ist die zentrale Pathologie für Typ-1- und Typ-2-Diabetes¹. Während Betazellen die Produzenten von Insulin in Pankreasinseln sind, spielt die Kommunikation zwischen Betazellen und Nicht-Beta-Zellen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der Insulinsekretion². Darüber hinaus trägt die Dysregulation der Glucagon-Sekretion zu Hyperglykämie bei Diabetes³bei. Daher besteht ein starkes Interesse daran, die Genexpression von Zellen innerhalb der Pankreasinseln zu modulieren, um den Mechanismus hinter der Entwicklung von Inselfunktionsstörungen bei Diabetes anzugehen. Es gibt eine Vielzahl von Ansätzen, einschließlich transgener Mäuse, um die Genexpression von Mausinseln zu modulieren. Jedoch, menschliche und Maus-Inseln zeigen deutliche Innervation, Zellverteilung, Verhältnis von Beta-Alpha-Zellen, und Reaktion auf Sekretagogen⁴. Daher ist die direkte Beurteilung der Genfunktion bei menschlichen Inseln äußerst wichtig für das Verständnis der Pathophysiologie menschlicher Pankreasinseln.

Adenoviraler Vektor ist der am weitesten verbreitete virale Vektor, um Pankreasinseln in vitro zu transducen, da die Transduktion in nicht teilenden Zellen hoch ist. Jedoch, Adenovirus dringt nicht in den Kern der Inselchen effizient, vor allem bei menschlichen Inseln⁵, und ist zytotoxisch bei hohen Dosen⁶. Im Vergleich dazu ist der lentivirale Vektor weniger zytotoxisch und liefert exogene Gene dauerhaft in das Chromosom postmitotischer Zellen, was ihn zu einem weithin getesteten Vehikel für die Gentherapie^{macht 7}. Allerdings ist auch die Fähigkeit des Lentivirus, in den Kern intakter menschlicher Inseln einzudringen, begrenzt, so dass eine partielle Dispersion durch enzymatische Verdauung erforderlich ist, um die Transduktionseffizienz zu erhöhen⁸. Der Vorbehalt mit der Dispersion intakter menschlicher Inseln ist die Unterbrechung der Zellzell- und Zellmatrixkommunikation, die die dynamische Regulierung der Insulinsekretion beeinträchtigt, die für die Aufrechterhaltung der Glukosehomöostase beim Menschen entscheidend ist⁹. Daher war es schwierig, die Auswirkungen der Genmodulation auf die dynamische Regulierung der Inselfunktion in einem Modell menschlicher Inselchen zu bewerten.

Es ist bekannt, dass sich zerstreute Inselzellen von menschlichen und Nagetierinseln autonom zu inselähnlichen Strukturen, sogenannten “Pseudoislets”, zusammenschließen. Pseudoislets zeigen Beta- und Nicht-Beta-Zellverteilung ähnlich wie native Inselchen^10,11. Zusätzlich verlieren einheimische Inselchen nach langfristiger Kultur nach und nach robuste Sendephase Insulinsekretion^5,10,11,12. Dennoch zeigten Pseudoislets eine bessere Konservierung der Insulinsekretion der ersten Phase als Reaktion auf Glukose im Vergleich zu einheimischen Inselchen nach der gleichen Kulturperiode⁵. Neben einer besseren Konservierung der Insulinsekretion bietet die größengesteuerte Reaggregation menschlicher Isletzellen in niedrigen Anbauplatten¹¹ eine Möglichkeit, Lentivirus-Vektoren vor ihrer Reaggregation in Pseudoislets. Mehrere Studien haben den Nutzen von Pseudoislets in Kombination mit lentiviral vermittelter Transduktion nachgewiesen. Caton et al.¹³ berichteten, dass die Einführung des grünen fluoreszierenden Proteins (GFP), das Lentivirus ausdrückt, wenig Einfluss auf die Insulinsekretion hatte, während eine homogene Expression von GFP in Rattenpseudoislets im Vergleich zur nicht infizierten Kontrolle erreicht wurde. Sie zeigten auch die spezifische Wirkung verschiedener Connexine auf die Insulinsekretion, indem sie die Connexine 32, 36 und 43 über das Lentivirus¹³überexzieren. Menschliche Pseudoislets, die mit einer handelsüblichen 96-Well-Ultra-Low-Attachment-Platte hergestellt wurden, zeigten, dass die lentiviral-vermittelte Überexpression des Transkriptionsfaktors SIX3 die Insulinsekretion verbessert, die durch statische Inkubation bewertet wird¹⁴. Kürzlich wurden menschliche Pseudoislets, die mit einer 96-well ultra-niedrigen Anbauplatte hergestellt wurden, verwendet, um Glukokkinase über lentivirale Kurzhaarnadel-RNA (shRNA) als Beweis für den Nachweis zu regulieren, dass die glukosestimulierte Insulinsekretion reduziert wird, während KCl-stimulierte Insulinsekretion wurde⁵erhalten. Die Studie zeigte auch, dass menschliche Pseudoislets nativen Inselchen in Genexpression und sekretoreichen Profilen ähneln, was den Nutzen menschlicher Pseudoislets zur Sezieren der Regulation der Inselfunktion⁵weiter unterstützt. Obwohl die Perifusion nicht durchgeführt wurde, wurde eine biotechnologische Mikrobrunnen-Kulturplatte, die vor kurzem kommerziell erhältlich war, auch als kompatibel für lentivirale Transduktion und produzierte menschliche Pseudoislets, die ausgezeichnete Insuline Sekretion in vitro und in vivo nach Transplantation¹¹. Zusammen genommen ist die Bildung menschlicher Pseudoislet in Kombination mit der lentiviralen Transduktion ein einfacher und effizienter Ansatz zur Untersuchung der Pathophysiologie der menschlichen Insel und stellt ein wertvolles Werkzeug zur Durchführung mechanistischer Studien an menschlichen Inseln bereit.

Im aktuellen Bericht wird ein Protokoll zur Bildung menschlicher Pseudoislets, die mit Lentivirus über zwei kommerziell erhältliche Plattformen, eine 96-Well ultra-low Attachment Platte und eine Microwell-Kulturplatte transduziert wurden, vorgestellt. Beide erreichen eine effiziente Modulation der Genexpression und schaffen menschliche Pseudoislets, die für nachgelagerte Bewertungen, einschließlich statischer Inkubation und Perifusion, kompatibel sind.

Protocol

Vor Studienbeginn wurde eine Forschungsbestimmung für Humansubjekte durch das Institutional Review Board der University of Iowa getroffen, der feststellte, dass die Studie die Kriterien für die Forschung an menschlichen Probanden nicht erfüllte. Konsultieren Sie vor Beginn der Studie das örtliche Prüfungsgremium, um festzustellen, ob die Quelle der Inselchen und die geplante Studie einer vorherigen Genehmigung bedarf. HINWEIS: Für die Bildung von 192 Pseudoislets in der …

Representative Results

Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Schritte bei der Herstellung von Pseudoislets mit einer 96-well ultra-niedrigen Befestigungsplatte und einer Mikrowell-Kulturplatte. Abbildung 2a zeigt sequenzielle Veränderungen in der Morphologie bei der Bildung von Pseudoislets aus 3 x 103 menschlichen Inselzellen in einer 96-well ultraniedrigen Befestigungsplatte. Monolayer oder lose Zellklumpen, die am tag 1 beobachtet wurden, ve…

Discussion

Hier wird ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung menschlicher Pseudoislets vorgestellt, die mit einer 96-Well-Ultra-Low-Attachment-Platte oder einer Mikrowell-Kulturplatte durch Lentivirus transduziert werden. Pseudoislets sollen Morphologie und sekretotische Funktionen ähnlich wie einheimische menschliche Inselchen demonstrieren und können über einen längeren Zeitraum in vitro^kultiviertwerden 5^,11,18. Im Gegensatz zu ein…

Materials

Anti-adherence rinsing solution	Stemcell technologies	7919
Biological safety cabinet	Thermo Scientific	1300 Series Type A2
cell strainer, 40 micrometer	Corning	431750
CMRL-1066	ThermoFisher	11530037
CO2 incubator	Thermo Scientific	Heracell VIOS 160i
conical centrifuge tube, 15 mL	VWR	89039-666
conical centrifuge tube, 50 mL	VWR	89039-658
fetal bovine serum	ThermoFisher	26140079
guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent	ThermoFisher	15596026	Trizol
glutamine	ThermoFisher	25030164
Hemocytometer	Marien Feld	Neubauer-Improved Bright line
Human serum albumin	Sigma	A1653
inverted microscope	Fisher brand	11-350-119
microcentrifuge	Beckman Coulter	Microfuge 20
microcentrifuge tube, 1.5 mL	USA Scientific	1615-5500
microwell culture plate	Stemcell technologies	34411	Aggrewell 400, 24 well
motor-driven pestle	GAMUT	#399X644
non-tissue culture treated dish, 10 cm	Fisher Scientific	FB0875713
PBS	ThermoFisher	14190250
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher	10378016
Petri dish, 35 mm	Celltreat	229638
pipette, 5 mL	DOT Scientific,	667205B
pipette, 8-channel	VWR	#613-5253
pipette, 10 mL	VWR	667210B
pipette, P10	Denville	UEZ-P-10
pipette, P200	Denville	UEZ-P-200
pipette, P1000	Denville	UEZ-P-1000
proteolytic and collagenolytic enzyme mixture	Sigma	A6965	Accutase
reagent reservoir, 50 mL	VWR	89094-680
reversible strainer, 37 micrometer	Stemcell technologies	27251
swing bucket plate centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-14R
swing bucket rotor	Beckman Coulter	SX4750A
tuberculin syringe, 1 mL	BD	309659
ultra low attachment microplate, 96 well	Corning	4515