Lentiviral medieret genhæmning i humant Pseudoø fremstillet i lave fastgørelses plader
Summary
En protokol til oprettelse af genetisk modificerede humane pseudoisletter fra spredte humane ø-celler, der er transduceret af lentivirus med kort hårnål RNA (shRNA), er præsenteret. Denne protokol udnytter let tilgængelige enzym og kultur fartøjer, kan udføres nemt, og producerer genetisk modificerede humane pseudoisletter egnet til funktionelle og morfologiske undersøgelser.
Abstract
Forskellige genetiske værktøjer er tilgængelige til at moduere gener i bugspytkirtlen Holme af gnavere at dissekere funktion af ø gener for diabetes forskning. Imidlertid er de data, der er indhentet fra gnaver Holme, ofte ikke helt gengivet i eller gældende for menneskelige øer på grund af velkendte forskelle i øens struktur og funktion mellem arterne. I øjeblikket er teknikker, der er tilgængelige til at manipulere genekspression af menneskelige Holme, meget begrænsede. Indførelse af transgene i intakt Holme af adenovirus, plasmid, og oligonukleotider ofte lider af lav effektivitet og høj toksicitet. Lav effektivitet er især problematisk i gene downregulation undersøgelser i intakt Holme, som kræver høj effektivitet. Det har været kendt, at enzymatisk spredte ø-celler reaggregate i kultur danner sfæroider betegnes pseudoislets. Størrelses kontrolleret reaggregation af menneskelige ø-celler skaber pseudoisletter, der opretholder dynamisk første fase insulinsekretion efter langvarig kultur og giver et vindue til effektivt at introducere lentiviral kort hårnål RNA (shRNA) med lav toksicitet. Her beskrives en detaljeret protokol til oprettelse af humane pseudoisletter efter lentiviral transduktion ved hjælp af to kommercielt tilgængelige multiwell-plader. Protokollen kan let udføres og giver mulighed for effektiv downregulation af gener og vurdering af dynamikken i insulinsekretionen ved hjælp af humane ø-celler. Således, humane pseudoisletter med lentiviral medieret gen modulation giver en kraftfuld og alsidig model til at vurdere genfunktion inden for menneskelige ø-celler.
Introduction
Tabet af funktionel beta cellemasse er den centrale patologi for både type 1-og type 2-diabetes1. Mens beta celler er producenter af insulin i bugspytkirtlen Holme, kommunikation mellem beta celler og ikke-beta celler spiller en afgørende rolle i reguleringen af insulinsekretion2. Desuden, dysregulering af Glucagon sekretion bidrager til hyperglykæmi i diabetes3. Således er der stor interesse for at moduere genekspression af celler inden for pancreas-Holme for at løse mekanismen bag udviklingen af ø-dysfunktion i diabetes. En række forskellige tilgange, herunder Transgene mus er tilgængelige til at moduere genekspression af mus Holme. Men, menneskelige og mus Holme viser særskilte innervation, celle fordeling, forholdet mellem Beta til Alpha celler, og respons på secretagogues4. Derfor er direkte vurdering af gen funktion i menneskelige Holme er yderst vigtigt for forståelsen af Patofysiologi af humane pancreas Holme.
Adenoviral vektor er den mest udbredte virale vektor til transduce pancreas Holme in vitro på grund af den høje effektivitet af transduktion i ikke-dividere celler. Men, adenovirus ikke trænge ind i kernen af Holme effektivt, især i humane Holme5, og er cytotoksisk ved høje doser6. Forholdsvis, lentiviral vektor er mindre cytotoksisk og leverer eksogene gener permanent i kromosom af post-mitotiske celler, hvilket gør det til et bredt afprøvet køretøj til genterapi7. Men, evnen af lentivirus at trænge ind i kernen af intakt humane Holme er også begrænset, hvilket kræver delvis dispersion ved enzymatisk fordøjelse at øge transduktiviteten8. Den advarsel med spredningen af intakt menneskelige Holme er afbrydelse af celle-celle og celle-matrix kommunikation, som kompromitterer den dynamiske regulering af insulinsekretion kritisk for opretholdelse af glucosehomøostase i mennesker9. Derfor har det været udfordrende at vurdere virkningen af genmodulering på den dynamiske regulering af ø-funktionen i en model af menneskelige Holme.
Det har været kendt, at spredte ø-celler fra menneskelige og gnavere Holme selvstændigt reaggregate i Islet-lignende strukturer kaldet “pseudoislets”. Pseudoislets viser beta-og ikke-beta-celle distribution svarende til native Holme10,11. Desuden, efter langsigtet kultur, indfødte Holme gradvist miste robust første fase insulinsekretion5,10,11,12. Endnu, pseudoislets demonstreret bedre bevaring af første fase insulinsekretion som reaktion på glukose sammenlignet med indfødte Holme efter den samme kultur periode5. Ud over at have bedre bevarelse af insulinsekretionen, størrelses kontrolleret reaggregation af menneskelige ø-celler i lave vedhæftnings plader11 giver et vindue af muligheder for at introducere lentivirus vektorer før deres reaggregation i pseudoislets. Flere undersøgelser har påvist nytten af pseudoisletter kombineret med lentiviral medieret transduktion. Caton et al.13 rapporterede, at indførelsen af det grønne fluorescerende protein (gfp), der udtrykker lentivirus, havde ringe effekt på insulinsekretionen, samtidig med at man opnåede homogen ekspression af gfp i rotte pseudoisletter sammenlignet med ikke-inficeret kontrol. De viste også den specifikke virkning af forskellige connexiner på insulinsekretionen ved at overtale connexins 32, 36 og 43 via lentivirus13. Humane pseudoisletter fremstillet med en kommercielt tilgængelig 96-brønd ultra-lav vedhæftnings plade viste, at lentiviral-mediated overekspression af transkriptionsfaktor SIX3 forbedrer insulinsekretionen vurderet ved statisk inkubation14. For nylig blev humane pseudoisletter tilberedt med en 96-brønd ultra-lav fastgørelsesplade brugt til at nedregulere glucokinase via lentiviral kort hårnål RNA (shRNA) som et bevis på princippet for at vise, at glukose-stimuleret insulinsekretion er reduceret, mens KCl-stimuleret insulinsekretion blev bevaret5. Undersøgelsen viste også, at humane pseudoisletter ligner indfødte Holme i genekspression og sekretoriske profiler, yderligere støtte nytten af humane pseudoislets at dissekere reguleringen af ø funktion5. Selvom perifusion ikke blev udført, blev en biokonstrueret mikrobrønd kultur plade, der for nylig blev kommercielt tilgængelig, også rapporteret at være kompatibel for lentiviral transduktion og producerede humane pseudoislets, der udviste fremragende insulin sekretion in vitro og in vivo efter transplantation11. Kollektivt er menneskelig pseudo-ø dannelse kombineret med lentiviral transduktion en enkel og effektiv tilgang til at undersøge den menneskelige ø Patofysiologi, hvilket giver et værdifuldt værktøj til at udføre Mekanistiske undersøgelser i humane Holme.
I den nuværende rapport, en protokol til at danne humane pseudoislets transduceret med lentivirus ved hjælp af to kommercielt tilgængelige platforme, en 96-godt ultra-lav fastgørelse plade og en strips med mikrobrønde kultur plade er præsenteret. Begge opnår effektiv graduering af genekspression og skaber humane pseudoisletter, der er kompatible til downstream-vurderinger, herunder statisk inkubation og perifusion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her præsenteres en detaljeret protokol til at generere humane pseudoisletter, der er transduceret af lentivirus ved hjælp af en 96-brønd ultra-lav fastgørelsesplade eller en strips med mikrobrønde kultur plade. Pseudoislets er blevet rapporteret til at demonstrere morfologi og sekretoriske funktioner svarende til indfødte menneskelige Holme og kan dyrkes i længere tid in vitro5,11,18. I modsætning til indfødte menneskel…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansielt støttet af National Institutes of Health til Y.I. (R01-DK090490) og American diabetes Association til Y.I. (1-17-IBS-132). J.A. og Y.I. understøttes af den broderlige orden af Eagles Diabetes Research Center. A.B. støttes af et nationalt Institut for sundhedsuddannelse (T32NS45549). Forfattere udnyttet menneskelige pancreas Holme leveres af NIDDK-finansierede integreret Islet distribution program (IIDP) på City of Hope (2UC4DK098085).
Materials
| Anti-adherence rinsing solution | Stemcell technologies | 7919 | |
| Biological safety cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series Type A2 | |
| cell strainer, 40 micrometer | Corning | 431750 | |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530037 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | Heracell VIOS 160i | |
| conical centrifuge tube, 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| conical centrifuge tube, 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent | ThermoFisher | 15596026 | Trizol |
| glutamine | ThermoFisher | 25030164 | |
| Hemocytometer | Marien Feld | Neubauer-Improved Bright line | |
| Human serum albumin | Sigma | A1653 | |
| inverted microscope | Fisher brand | 11-350-119 | |
| microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 20 | |
| microcentrifuge tube, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5500 | |
| microwell culture plate | Stemcell technologies | 34411 | Aggrewell 400, 24 well |
| motor-driven pestle | GAMUT | #399X644 | |
| non-tissue culture treated dish, 10 cm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| PBS | ThermoFisher | 14190250 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Petri dish, 35 mm | Celltreat | 229638 | |
| pipette, 5 mL | DOT Scientific, | 667205B | |
| pipette, 8-channel | VWR | #613-5253 | |
| pipette, 10 mL | VWR | 667210B | |
| pipette, P10 | Denville | UEZ-P-10 | |
| pipette, P200 | Denville | UEZ-P-200 | |
| pipette, P1000 | Denville | UEZ-P-1000 | |
| proteolytic and collagenolytic enzyme mixture | Sigma | A6965 | Accutase |
| reagent reservoir, 50 mL | VWR | 89094-680 | |
| reversible strainer, 37 micrometer | Stemcell technologies | 27251 | |
| swing bucket plate centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-14R | |
| swing bucket rotor | Beckman Coulter | SX4750A | |
| tuberculin syringe, 1 mL | BD | 309659 | |
| ultra low attachment microplate, 96 well | Corning | 4515 |
Referências
- Chen, C., Cohrs, C. M., Stertmann, J., Bozsak, R., Speier, S. Human beta cell mass and function in diabetes: Recent advances in knowledge and technologies to understand disease pathogenesis. Molecular Metabolism. 6 (9), 943-957 (2017).
- Hong, H., Jo, J., Sin, S. J. Stable and flexible system for glucose homeostasis. Physiological Review E covering statistical, nonlinear, biological, and soft matter physic. 88 (3), 032711 (2013).
- Cryer, P. E. Minireview: Glucagon in the pathogenesis of hypoglycemia and hyperglycemia in diabetes. Endocrinology. 153 (3), 1039-1048 (2012).
- Arrojo e Drigo, R., et al. New insights into the architecture of the islet of Langerhans: a focused cross-species assessment. Diabetologia. 58 (10), 2218-2228 (2015).
- Harata, M., et al. Delivery of shRNA via lentivirus in human pseudoislets provides a model to test dynamic regulation of insulin secretion and gene function in human islets. Physiological Reports. 6 (20), e13907 (2018).
- Barbu, A. R., Akusjarvi, G., Welsh, N. Adenoviral-mediated transduction of human pancreatic islets: importance of adenoviral genome for cell viability and association with a deficient antiviral response. Endocrinology. 146 (5), 2406-2414 (2005).
- Hughes, A., et al. Gene therapy to improve pancreatic islet transplantation for Type 1 diabetes mellitus. Current Diabetes Reviews. 6 (5), 274-284 (2010).
- Jimenez-Moreno, C. M., et al. A Simple High Efficiency Intra-Islet Transduction Protocol Using Lentiviral Vectors. Current Gene Therapy. 15 (4), 436-446 (2015).
- Bonora, E., et al. Prevalence and correlates of post-prandial hyperglycaemia in a large sample of patients with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49 (5), 846-854 (2006).
- Halban, P. A., Powers, S. L., George, K. L., Bonner-Weir, S. Spontaneous reassociation of dispersed adult rat pancreatic islet cells into aggregates with three-dimensional architecture typical of native islets. Diabetes. 36 (7), 783-790 (1987).
- Yu, Y., et al. Bioengineered human pseudoislets form efficiently from donated tissue, compare favourably with native islets in vitro and restore normoglycaemia in mice. Diabetologia. 61 (9), 2016-2029 (2018).
- Zuellig, R. A., et al. Improved physiological properties of gravity-enforced reassembled rat and human pancreatic pseudo-islets. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (1), 109-120 (2017).
- Caton, D., et al. Lentivirus-mediated transduction of connexin cDNAs shows level- and isoform-specific alterations in insulin secretion of primary pancreatic beta-cells. Journal of Cell Science. 116 (Pt 11), 2285-2294 (2003).
- Arda, H. E., et al. Age-Dependent Pancreatic Gene Regulation Reveals Mechanisms Governing Human beta Cell Function. Cell Metabolism. 23 (5), 909-920 (2016).
- Peiris, H., et al. Discovering human diabetes-risk gene function with genetics and physiological assays. Nature Communications. 9 (1), 3855 (2018).
- Schlimgen, R., et al. Risks Associated With Lentiviral Vector Exposures and Prevention Strategies. Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Li, N., et al. Engineering islet for improved performance by optimized reaggregation in alginate gel beads. Biotechnology and Applied Biochemistry. 64 (3), 400-405 (2017).
- Ramachandran, K., Peng, X., Bokvist, K., Stehno-Bittel, L. Assessment of re-aggregated human pancreatic islets for secondary drug screening. British Journal of Pharmacology. 171 (12), 3010-3022 (2014).
- Hilderink, J., et al. Controlled aggregation of primary human pancreatic islet cells leads to glucose-responsive pseudoislets comparable to native islets. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 19 (8), 1836-1846 (2015).
- Saunders, D. C., et al. Ectonucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase-3 Antibody Targets Adult Human Pancreatic beta Cells for In Vitro and In Vivo Analysis. Cell Metabolism. (18), (2018).
- Reissaus, C. A., Piston, D. W. Reestablishment of Glucose Inhibition of Glucagon Secretion in Small Pseudoislets. Diabetes. 66 (4), 960-969 (2017).
