Lentiviral मध्यस्थता जीन Silencing में मानव Peudoislet कम अनुलग्नक प्लेट्स में तैयार
Summary
छितरी हुई मानव आइलेट कोशिकाओं से जीन संशोधित मानव छद्म-लेट्स बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल जो छोटे हेयरपिन आरएनए (shRNA) ले जाने वाले lentivirus द्वारा ट्रांसड्यूसर द्वारा ट्रांसड्यूसर किया जाता है। इस प्रोटोकॉल आसानी से उपलब्ध एंजाइम और संस्कृति वाहिकाओं का इस्तेमाल करता है, आसानी से किया जा सकता है, और कार्यात्मक और आकृतिविज्ञान अध्ययन के लिए उपयुक्त आनुवंशिक रूप से संशोधित मानव छद्म उपयोग का उत्पादन करता है।
Abstract
विभिन्न आनुवंशिक उपकरण मधुमेह अनुसंधान के लिए आइलेट जीन के समारोह विच्छेदन करने के लिए कृन्तकों के अग्नाशयis में जीन ों को व्यवस्थित करने के लिए उपलब्ध हैं। हालांकि, कृंतक आइलेट्स से प्राप्त डेटा अक्सर पूरी तरह से में पुनरुत्पादित या islet में प्रसिद्ध मतभेद के कारण मानव islets के लिए लागू नहीं कर रहे हैं और प्रजातियों के बीच समारोह. वर्तमान में, तकनीक है कि मानव islets के जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर करने के लिए उपलब्ध हैं बहुत सीमित हैं. एडेनोवायरस, प्लाज्मिड, और ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स द्वारा अक्षुण्ण आइलेट्स में ट्रांसजीन का परिचय अक्सर कम दक्षता और उच्च विषाक्तता से ग्रस्त होता है। कम दक्षता बरकरार islets, जो उच्च दक्षता की आवश्यकता में जीन downregulation अध्ययन में विशेष रूप से समस्याग्रस्त है. यह ज्ञात हुआ है कि एंजाइमी रूप से विक्षिप्त आइलेट कोशिकाएं संस्कृति में पुन: एकत्रित होती हैं जिसे स्यूडोइड कहते हैं। मानव आइलेट कोशिकाओं के आकार-नियंत्रित पुनर्समूहीकरण छद्म आइसिसलेट बनाता है जो लंबे समय तक संस्कृति के बाद गतिशील पहले चरण इंसुलिन स्राव को बनाए रखता है और कम विषाक्तता के साथ lentiviral शॉर्ट हेयरपिन आरएनए (shRNA) को कुशलतापूर्वक पेश करने के लिए एक खिड़की प्रदान करता है। यहाँ, दो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मल्टीवेल प्लेटों का उपयोग कर lentiviral transduction के बाद मानव pseudoislets के निर्माण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है. प्रोटोकॉल आसानी से किया जा सकता है और जीन के कुशल downregulation और मानव आइलेट कोशिकाओं का उपयोग कर इंसुलिन स्राव की गतिशीलता के आकलन के लिए अनुमति देता है. इस प्रकार, lentiviral मध्यस्थता जीन मॉडुलन के साथ मानव pseudoislets मानव आइलेट कोशिकाओं के भीतर जीन समारोह का आकलन करने के लिए एक शक्तिशाली और बहुमुखी मॉडल प्रदान करते हैं।
Introduction
कार्यात्मक बीटा सेल द्रव्यमान का नुकसान दोनों प्रकार 1 और प्रकार 2 मधुमेह1के लिए केंद्रीय विकृति है . जबकि बीटा कोशिकाओं अग्नाशय islets में इंसुलिन के निर्माता हैं, बीटा कोशिकाओं और गैर बीटा कोशिकाओं के बीच संचार इंसुलिन स्राव2के विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. इसके अलावा, ग्लूकागन स्राव का डिस्रेग्यूलेशन मधुमेह3में हाइपरग्लेसेमिया में योगदान देता है। इस प्रकार, मधुमेह में आइलेट रोग के विकास के पीछे तंत्र को संबोधित करने के लिए अग्नाशयी आइलेट्स के भीतर कोशिकाओं की जीन अभिव्यक्ति को मॉड्युलेट करने के लिए मजबूत रुचि है। ट्रांसजेनिक चूहों सहित दृष्टिकोण की एक किस्म माउस islets के जीन अभिव्यक्ति को मॉड्युलेट करने के लिए उपलब्ध हैं. हालांकि, मानव और माउस आइलेट्स अलग innervation, सेल वितरण, अल्फा कोशिकाओं के लिए बीटा के अनुपात, और secretagogues4के लिए प्रतिक्रिया दिखाते हैं। इसलिए, मानव islets में जीन समारोह का प्रत्यक्ष मूल्यांकन मानव अग्नाशय islets के pathophysiology को समझने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है.
एडेनोवायरल वेक्टर, गैर-विभाजित कोशिकाओं में ट्रांसडक्शन की उच्च दक्षता के कारण विट्रो में अग्नाशयी आइलेट्स को ट्रांसड्यूस करने के लिए सबसे व्यापक रूप से प्रयुक्त वायरल वेक्टर है। हालांकि, एडेनोवायरस islets के कोर में कुशलता से प्रवेश नहीं करता है, विशेषरूप से मानव आइलेट्स5में , और उच्च खुराक 6 पर साइटोटॉक्सिक है। तुलनात्मक रूप से, मसूरीवायरल वेक्टर कम साइटोटॉक्सिक होता है और बाह्य जीनों को पोस्ट-माइटोटिक कोशिकाओं के गुणसूत्र में स्थायी रूप से बचाता है, जिससे यह जीन चिकित्सा7के लिए एक व्यापक रूप से परीक्षण किया गया वाहन बना देता है। हालांकि, अक्षुण्ण मानव आइलेट्स के कोर में प्रवेश करने के लिए lentivirus की क्षमता भी सीमित है, इस प्रकार एंजाइमी पाचन द्वारा आंशिक फैलाव की आवश्यकता के लिए transduction दक्षता8में वृद्धि. बरकरार मानव islets के फैलाव के साथ चेतावनी सेल सेल और सेल मैट्रिक्स संचार, जो मनुष्यों में ग्लूकोज homeostasis के रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण इंसुलिन स्राव के गतिशील विनियमन समझौता9के रुकावट है. इस प्रकार, मानव आइलेट के एक मॉडल में आइलेट फंक्शन के गतिशील विनियमन पर जीन मॉडुलन के प्रभाव का आकलन करना चुनौतीपूर्ण रहा है।
यह ज्ञात किया गया है कि मानव और कृंतक से छितरी हुई आइलेट कोशिकाओं को स्वायत्त रूप से आइलेट की तरह संरचनाओं में पुन: व्यवस्थित किया जाता है जिसे “स्यूडोइसलेट” कहा जाता है। कूटाश्मित्यै ववववववववववववववववववववववववववववववववववववववववववववववववववववववववववववव इसके अतिरिक्त, दीर्घकालिक संस्कृति के बाद, देशी islets उत्तरोत्तर मजबूत पहले चरण इंसुलिन स्राव5,10,11,12खो देते हैं. फिर भी, छद्मइस्लेट ने उसी संस्कृति अवधि5के बाद देशी आइलेट्स की तुलना में ग्लूकोज के जवाब में पहले चरण इंसुलिन स्राव के बेहतर संरक्षण का प्रदर्शन किया। इंसुलिन स्राव के बेहतर संरक्षण होने के अलावा, कम लगाव प्लेटों में मानव आइलेट कोशिकाओं के आकार-नियंत्रित पुनर्समूहीकरण11 में उनके reaggregation से पहले lentivirus वैक्टर लागू करने का अवसर प्रदान करता है छद्म-इस्लेट। कई अध्ययनों से lentiviral मध्यस्थता transduction के साथ संयुक्त pseudoislets की उपयोगिता का प्रदर्शन किया है. Caton एट अल13 की सूचना दी है कि हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की शुरूआत (GFP) lenivirus व्यक्त इंसुलिन स्राव पर थोड़ा प्रभाव पड़ा है, जबकि चूहे pseudoislets में GFP की समरूप अभिव्यक्ति को प्राप्त करने के गैर संक्रमित नियंत्रण के साथ तुलना में. उन्होंने यह भी connexins 32, 36, और 43 lentivirus13के माध्यम से overexpressing द्वारा इंसुलिन स्राव पर विभिन्न connexins के विशिष्ट प्रभाव का प्रदर्शन किया. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 96-वेल अल्ट्रा-कम आसक्मेंट प्लेट के साथ तैयार किए गए मानव छद्म-पत्रों ने दिखा दिया कि ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर SIX3 के lentiviral-मध्यस्थ overexpression स्थैतिक ऊष्मायन14द्वारा मूल्यांकन इंसुलिन स्राव में सुधार करता है। हाल ही में, एक 96 अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव प्लेट के साथ तैयार मानव pseudoislets lentiviral लघु hairpin आरएनए (shRNA) के माध्यम से glucokinase को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया गया सिद्धांत के एक सबूत के रूप में दिखाने के लिए कि ग्लूकोज उत्तेजित इंसुलिन स्राव कम हो जाता है, जबकि केसीएल प्रेरित इंसुलिन स्राव को संरक्षित किया गया था5. अध्ययन में यह भी प्रदर्शित किया गया है कि मानव छद्मरूप जीन अभिव्यक्ति और स्रावी प्रोफाइल में देशी आइलेट्स के समान हैं, जो इसलेट फंक्शन5के विनियमन को विभाजित करने के लिए मानव छद्म-इस्लेट की उपयोगिता का समर्थन करते हैं। हालांकि perifusion प्रदर्शन नहीं किया गया था, एक bioengineered microwell संस्कृति प्लेट है कि हाल ही में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हो गया, भी lentiviral transduction के लिए संगत होने की सूचना दी और मानव छद्म islets कि उत्कृष्ट इंसुलिन का प्रदर्शन किया प्रत्यारोपण के बाद इन विट्रो और विवो में स्राव11| सामूहिक रूप से, मसूरीवायरल ट्रांसडक्शन के साथ संयुक्त मानव स्यूडोइसलेट गठन मानव आइलेट पैथोफिजियोलॉजी की जांच करने के लिए एक सरल और कुशल दृष्टिकोण है, जो मानव आइलेट्स में मशीनी अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करता है।
वर्तमान रिपोर्ट में, दो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लेटफार्मों का उपयोग कर के lentivirus के साथ ट्रांसड्यूस ट्रांसड्यूस के साथ ट्रांसड्यूस के साथ ट्रांसड्यूसर बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल, एक 96-वेल अल्ट्रा कम लगाव प्लेट और एक माइक्रोवेल संस्कृति प्लेट प्रस्तुत की है। दोनों जीन अभिव्यक्ति के कुशल मॉडुलन को प्राप्त करने और मानव pseudoislets कि स्थिर ऊष्मायन और perifusion सहित बहाव आकलन के लिए संगत कर रहे हैं बनाएँ.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, मानव pseudoislets कि एक 96 अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव प्लेट या एक microwell संस्कृति प्लेट का उपयोग कर lentivirus द्वारा ट्रांसड्यूस कर रहे हैं उत्पन्न करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है. छद्मरूपों को ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम वित्तीय रूप से Y.I. (R01-DK090490) और अमेरिकन डायबिटीज एसोसिएशन को Y.I. (1-17-IBS-132) के लिए स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था. जे.ए. और Y.I. ईगल्स मधुमेह अनुसंधान केंद्र के भाईचारे के आदेश द्वारा समर्थित हैं. ए.बी. स्वास्थ्य प्रशिक्षण अनुदान के एक राष्ट्रीय संस्थान (T32NS45549) द्वारा समर्थित है. लेखकों मानव अग्नाशय islets NIDDK द्वारा प्रदान की-वित्त पोषित एकीकृत आइलेट वितरण कार्यक्रम (IIDP) आशा के सिटी में (2UC4DK098085).
Materials
| Anti-adherence rinsing solution | Stemcell technologies | 7919 | |
| Biological safety cabinet | Thermo Scientific | 1300 Series Type A2 | |
| cell strainer, 40 micrometer | Corning | 431750 | |
| CMRL-1066 | ThermoFisher | 11530037 | |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | Heracell VIOS 160i | |
| conical centrifuge tube, 15 mL | VWR | 89039-666 | |
| conical centrifuge tube, 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent | ThermoFisher | 15596026 | Trizol |
| glutamine | ThermoFisher | 25030164 | |
| Hemocytometer | Marien Feld | Neubauer-Improved Bright line | |
| Human serum albumin | Sigma | A1653 | |
| inverted microscope | Fisher brand | 11-350-119 | |
| microcentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 20 | |
| microcentrifuge tube, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5500 | |
| microwell culture plate | Stemcell technologies | 34411 | Aggrewell 400, 24 well |
| motor-driven pestle | GAMUT | #399X644 | |
| non-tissue culture treated dish, 10 cm | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| PBS | ThermoFisher | 14190250 | |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 10378016 | |
| Petri dish, 35 mm | Celltreat | 229638 | |
| pipette, 5 mL | DOT Scientific, | 667205B | |
| pipette, 8-channel | VWR | #613-5253 | |
| pipette, 10 mL | VWR | 667210B | |
| pipette, P10 | Denville | UEZ-P-10 | |
| pipette, P200 | Denville | UEZ-P-200 | |
| pipette, P1000 | Denville | UEZ-P-1000 | |
| proteolytic and collagenolytic enzyme mixture | Sigma | A6965 | Accutase |
| reagent reservoir, 50 mL | VWR | 89094-680 | |
| reversible strainer, 37 micrometer | Stemcell technologies | 27251 | |
| swing bucket plate centrifuge | Beckman Coulter | Allegra X-14R | |
| swing bucket rotor | Beckman Coulter | SX4750A | |
| tuberculin syringe, 1 mL | BD | 309659 | |
| ultra low attachment microplate, 96 well | Corning | 4515 |
Referências
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