Aqui, é apresentado um modelo experimental de isquemia do membro posterior crítico, seguido de uma bateria de testes funcionais, histológicos e moleculares para avaliar a efetividade das terapias angiogênicas.
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Artigo de método
Avaliando a angiogênese terapêutica em um modelo murino de isquemia Retromembro
Neste artigo
Resumo
Resumo
A isquemia crítica do membro (CLI) é uma condição séria que implique um risco elevado de uma amputação mais baixa do membro. Apesar da revascularização ser a terapia padrão-ouro, um número considerável de pacientes com CLI não é adequado para revascularização cirúrgica ou endovascular. As terapias angiogénicas estão emergindo como uma opção para estes pacientes mas estão atualmente ainda a investigação. Antes da aplicação em seres humanos, essas terapias devem ser testadas em modelos animais e seus mecanismos devem ser claramente compreendidos. Um modelo animal da isquemia do hindmembro (HLI) foi desenvolvido pela ligadura e pela excisão das artérias ilíacas e femoral externas longe do ponto de origem e das veias nos ratos. Um painel detalhado dos testes foi montado para avaliar os efeitos da isquemia e de terapias angiogênico putativo em níveis funcionais, histologic e moleculars. O laser Doppler foi utilizado para a mensuração do fluxo e avaliação funcional da perfusão. A resposta tecidual foi avaliada pela análise da densidade capilar após coloração com o anticorpo CD31 em cortes histológicos do músculo gastrocnêmio e pela mensuração da densidade de vasos colaterais após a diaphonização. A expressão de genes angiogênicos foi quantificada por RT-PCR visando fatores angiogênicos selecionados exclusivamente em células endoteliais (ECS) após microdissecção de captura a laser de músculos gastrocnêmio de camundongos. Esses métodos foram sensíveis na identificação de diferenças entre os membros isquêmicos e não isquêmicos e entre os membros tratados e não tratados. Este protocolo fornece um modelo reprodutível de CLI e uma estrutura para testar terapias angiogênico.
Introdução
A doença arterial periférica (PAD) acomete predominantemente os membros inferiores. A PAD é causada pela aterosclerose, uma obstrução da artéria que pode causar severa restrição ao fluxo sanguíneo nos membros inferiores1. A claudicação intermitente é a primeira manifestação da PAD e refere-se à dor muscular ao caminhar. A CLI é o estágio mais grave da PAD, sendo diagnosticada em pacientes que apresentam dor de repouso isquêmica, úlceras ou gangrena2. Pacientes com CLI apresentam alto risco de amputação, especialmente se não forem tratados3. A revascularização do membro inferior (seja por cirurgia ....
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Protocolo
Todos os procedimentos em animais estão em conformidade com a diretiva 2010/63/UE e foram aprovados pelo organismo institucional de bem-estar animal e licenciados pela DGAV, a autoridade portuguesa competente para a protecção dos animais (número de licença 023861/2013)
Cuidado: diversos dos produtos químicos usados nos protocolos são tóxicos e prejudiciais. Por favor, use todas as práticas de segurança apropriadas e equipamentos de proteção individual (luvas, jaleco, calça de corpo inteiro e sapatos de dedo fechado)
1. o modelo murino de isquemia do membro posterior
Nota: todos os experi....
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Resultados
Usando o protocolo descrito, as pilhas de haste mesenquimais do cabo de cordão umbilical e a radiação ionizante da baixo-dose (ldir) foram testadas como terapias angiogénicas putativo 11,12. As leituras da perfusão do laser Doppler foram obtidas antes da indução da isquemia e em temporais pré-especificados que variam de imediatamente após a indução da isquemia a 45 dias após a isquemia. As leituras de perfusão tecidual por Doppler laser foram registradas como ima.......
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Discussão
Os modelos de Murine de CLI consistiram na maior parte na ligadura da artéria femoral apenas distal à origem do femoral do profunda 4,5,6,7,8,9. Isto demonstrou deixar intacta a maior parte da circulação colateral, o que restaura o fluxo sanguíneo para o membro no prazo de 7 dias 9. A remoção da cama c.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos a José Rino e Tânia carvalho, chefes da unidade de Bioimagem e histologia e laboratório de patologia comparativa do Instituto de medicina molecular João Lobo Antunes, respectivamente. Agradecemos também Vyacheslav Sushchyk do departamento de anatomia da nova Medical School/Faculdade de ciências médicas, Universidade Nova de Lisboa.
Referência de financiamento: projeto financiado pela UID/IC/0306/2016 Fundação para a ciência e a tecnologia. Paula de Oliveira é apoiada por uma bolsa de estudos (SFRH/BD/80483/2011) da Fundação para a ciência e tecnologia.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 7500 PCR rápido em tempo real | aplicado | ||
| Acetona | Merk | 1000141000 | reagente; Cuidado - altamente inflamável |
| Reagente | adenosina | Valdepharm | |
| Atipamezole | OrionPharma | Reagente | |
| Sulfato de bário (Micropaque) | Guebert | 8671404 (ref. Infarmed) | Reagente |
| Buprenorfina | RichterPharma | Reagente | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC | Microscopia Carl Zeiss, Alemanha | Instrumento | |
| cDNA RT2 PreAMP kit de síntese de cDNA | Qiagen | 7335730 | Reagente |
| Cryostat Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | |
| Instrumento DAB kit de substrato de peroxidase | DAKO; Reagente Vector Laboratories | K3468 | |
| peroxidase de hidrogênio | Merk | 1072090250 | Reagente; Cuidado - |
| caneta hidrofóbica | Dako | 411121 | Reagent; Cuidado - tóxico |
| Ketamidor | Richterpharma | CN: 580393,7 630/01/12 Dfvf | Reagente |
| Laser Doppler perfusão imager moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, Reino Unido | 5710 | |
| Instrumento Leica DM2500 microscópio de campo claro vertical | Leica Microsystems | Instrumento | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | Reagente |
| metanol | VWR | UN1230 | Reagente; Cuidado - reagente |
| Papaverine | Labesfal | ||
| Pentano Isso | Merk | 1060561000 | Reagent; Cuidado - altamente inflamável |
| Power SYBR® Green | Applied Biosystems | 4309155 | |
| Reagente Purificado rato anti-rato CD31 | Pharmingen | 550274 | |
| Reagente RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 | Reagente |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | Sutura |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, IgG de Rato) | Kit Vectastain ABC; Vector Laboratories | PK-4004 | Reagente |
| Vicryl5.0 / Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202 / UL101 | Sutura |
| Zeiss PALM MicroBeam Sistema de Microdissecção a Laser | Carl Zeiss, Alemanha | 1023290916 | Instrumento |
| Microscópio estereotáxico | Carl Zeiss Microscopy, Alemanha | Instrumento | |
| Câmera digital | Linux | instrumento |
Referências
- Becker, F., et al. Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).
- Fowkes, F. G., et al. Per....
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Reimpressões e permissões
