Beoordeling van therapeutische angiogenese in een Muriene model van Hindledemaat ischemie
Summary
Hier wordt een kritisch hindledemaat ischemie-experimentele model gepresenteerd, gevolgd door een batterij met functionele, histologische en moleculaire tests om de effectiviteit van angiogene therapieën te beoordelen.
Abstract
Kritische ledemaat ischemie (CLI) is een ernstige aandoening die een hoog risico op amputatie van de onderste ledematen met zich meebrengt. Ondanks dat revascularisatie de Gold-standaard therapie is, zijn een aanzienlijk aantal CLI-patiënten niet geschikt voor chirurgische of endovasculaire revascularisatie. Angiogene therapieën verschijnen als een optie voor deze patiënten, maar zijn momenteel nog in onderzoek. Vóór toepassing bij de mens moeten deze therapieën in diermodellen worden getest en moeten de mechanismen ervan duidelijk worden begrepen. Een diermodel van hindledemaat ischemie (HLI) is ontwikkeld door de ligatie en excisie van de distale externe iliacale en femorale slagaders en aders in muizen. Een uitgebreid panel van tests werd samengesteld om te beoordelen van de effecten van ischemie en putatieve angiogene therapieën op functionele, histologische en moleculaire niveaus. Laser Doppler werd gebruikt voor de stromingsmeting en functionele beoordeling van perfusie. Weefsel respons werd geëvalueerd door de analyse van capillaire dichtheid na kleuring met het anti-CD31 antilichaam op histologische secties van gastrocnemius-spier en door meting van de dichtheid van het onderpand vaartuig na diaphonisatie. Expressie van angiogene genen werd gekwantificeerd door RT-PCR gericht op geselecteerde angiogene factoren uitsluitend in endotheel cellen (ECs) na laser Capture micro dissectie van muizen gastrocnemius spieren. Deze methoden waren gevoelig voor het identificeren van verschillen tussen ischemische en niet-ischemische ledematen en tussen behandelde en niet-behandelde ledematen. Dit protocol biedt een reproduceerbaar model van CLI en een kader voor het testen van angiogene therapieën.
Introduction
Perifere arteriële ziekte (PAD) beïnvloedt voornamelijk de onderste ledematen. PAD wordt veroorzaakt door atherosclerose, een slagader obstructie die kan leiden tot ernstige beperking van de bloedtoevoer in de onderste ledematen1. Intermitterende intermittens is de eerste manifestatie van PAD en verwijst naar spierpijn tijdens het lopen. CLI is de meest ernstige fase van PAD, wordt gediagnosticeerd bij patiënten die ischemische rust pijn vertonen, zweren of gangreen2. Patiënten met CLI hebben een hoog risico op amputatie, vooral als onbehandeld3. De revascularisatie van de onderste ledematen (ofwel door een open operatie of een endovasculaire procedure) is momenteel de enige manier om ledematen te redden. Echter, ongeveer 30% van de CLI-patiënten zijn niet geschikt voor deze procedures, om redenen die de locatie van de laesies omvatten, het patroon van arteriële occlusie en uitgebreide comorbiditeit4,5. Daarom zijn er nieuwe therapieën nodig voor deze anders onbehandelbare patiënten, waarbij de bevordering van angiogenese de strategie is onder intenser onderzoek.
Voor het testen bij de mens moet de effectiviteit en veiligheid van nieuwe therapieën in vivo in diermodellen worden overwogen. Er zijn verschillende modellen ontwikkeld voor de studie van CLI, voornamelijk door het induceren van hindledemaat ischemie (HLI) bij muizen6,7,8,9,10. Echter, deze modellen verschillen in verschillende aspecten, met inbegrip van de aard van de slagaders die zijn geligeerd en/of uitgesneden en of de aderen en zenuwen rond worden ontleed als goed6,7,8, 9,10. Tezamen zullen deze aspecten van invloed zijn op de ernst van het ischemie-reperfusie letsel in elk dier, waardoor de resultaten moeilijk te vergelijken zijn. Daarom is het van cruciaal belang om een effectief protocol te ontwikkelen waarin de procedure voor het opwekken van ischemie en de evaluatie van verschillende doelstellingen moet worden gestandaardiseerd om te beoordelen of een bepaalde angiogene therapie effectief zal zijn. Een experimenteel protocol dat is ontworpen om al deze aspecten te dekken, zou een uitgebreid inzicht geven in de mechanismen waarmee angiogene therapieën hun effecten en een maatstaf van hun werkzaamheid bij elk van hun uitkomsten kunnen uitoefenen. Twee verschillende werken die onlangs door ons team zijn gepubliceerd, zijn een goed voorbeeld11,12, waarin verschillende benaderingen voor het opwekken van therapeutische angiogenese werden beoordeeld aan de hand van hetzelfde protocol dat met meer detail wordt beschreven in deze Protocol.
Het algemene doel van dit protocol is het beschrijven van een reproduceerbaar experimenteel model dat de effecten van CLI kan nabootsen en de experimentele basis legt voor een uitgebreide beoordeling van de functionele, histologische en moleculaire effecten van vermoedelijke angiogene Agenten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Murine-modellen van CLI bestonden voornamelijk uit ligatie van de femorale slagader die net de oorzaak was van de profunda musculus femoris 4,5,6,7,8,9. Dit heeft aangetoond dat het grootste deel van de onderpand circulatie intact blijft, wat de bloedtoevoer naar de ledemaat herstelt binnen 7 dagen 9. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken José Rino en Tânia Carvalho, de hoofden van de Bioimaging Facility en het laboratorium voor histologie en vergelijkende pathologie van het Instituto de Medicina moleculaire João Lobo Antunes. We danken ook Vyacheslav Sushchyk van het departement anatomie van Nova Medical School/Faculdade de Ciências Médicas, Universidade Nova de Lisboa.
Financierings Referentie: project gefinancierd door UID/IC/0306/2016 Fundação para a Ciência e a tecnologia. Paula de Oliveira wordt ondersteund door een Fellowship (SFRH/BD/80483/2011) van Fundação para a Ciência e Tecnologia.
Materials
| 7500 Fast Real-Time PCR | Applied Biosystems | Instrument | |
| Acetone | Merk | 1000141000 | Reagent; Caution – highly flammable |
| Adenosine | Valdepharm | Reagent | |
| Atipamezole | OrionPharma | Reagent | |
| Barium sulphate (Micropaque) | Guebert | 8671404 (ref. Infarmed) | Reagent |
| Buprenorphine | RichterPharma | Reagent | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| cDNA RT2 PreAMP cDNA Synthesis kit | Qiagen | 7335730 | Reagent |
| Cryostat Leica CM | Leica Microsystems | 3050S | Instrument |
| DAB peroxidase substrate kit | DAKO;Vector Laboratories | K3468 | Reagent |
| hydrogen peroxidase | Merk | 1072090250 | Reagent; Caution – nocif |
| hydrophobic pen | Dako | 411121 | Reagent; Caution – toxic |
| Ketamidor | Richterpharma | CN:580393,7 630/01/12 Dfvf | Reagent |
| Laser Doppler perfusion imager moorLDI2-HIR | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK | 5710 | Instrument |
| Leica DM2500 upright brightfield microscope | Leica Microsystems | Instrument | |
| Medetor | Virbac | 037/01/07RFVPT | Reagent |
| methanol | VWR | UN1230 | Reagent; Caution – toxic and highly flammable |
| Papaverine | Labesfal | Reagent | |
| Pentano Isso | Merk | 1060561000 | Reagent; Caution – highly flammable |
| Power SYBR® Green | Applied Biosystems | 4309155 | Reagent |
| Purified rat anti-mouse CD31 | Pharmingen | 550274 | Reagent |
| RNeasy Micro kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Surgic-Pro 6.0 | Medtronic (Coviden) | VP733X | Suture |
| VECTASTAIN ABC HRP Kit (Peroxidase, Rat IgG) | Vectastain ABC kit; Vector Laboratories | PK-4004 | Reagent |
| Vicryl5.0/ Vicryl 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL202/ UL101 | Suture |
| Zeiss PALM MicroBeam Laser Microdissection System | Carl Zeiss Microscopy, Germany | 1023290916 | Instrument |
| Stereotaxic microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | Instrument | |
| Digital camera | Linux | Instrument |
Referências
- Becker, F., et al. Chapter I: Definitions, epidemiology, clinical presentation and prognosis. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 42 Suppl 2, S4-S12 (2011).
- Fowkes, F. G., et al. Peripheral artery disease: epidemiology and global perspectives. Nature Reviews Cardiology. 14 (3), 156-170 (2017).
- Abu Dabrh, A. M., et al. The natural history of untreated severe or critical limb ischemia. Journal of Vascular Surgery. 62 (6), 1642-1651 (2015).
- Lejay, A., et al. A new murine model of sustainable and durable chronic critical limb ischemia fairly mimicking human pathology. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 49 (2), 205-212 (2015).
- Sprengers, R. W., Lips, D. J., Moll, F. L., Verhaar, M. C. Progenitor cell therapy in patients with critical limb ischemia without surgical options. Annals of Surgery. 247 (3), 411-420 (2008).
- Lotfi, S., et al. Towards a more relevant hind limb model of muscle ischaemia. Atherosclerosis. 227 (1), 1-8 (2013).
- Masaki, I., et al. Angiogenic gene therapy for experimental critical limb ischemia: acceleration of limb loss by overexpression of vascular endothelial growth factor 165 but not of fibroblast growth factor-2. Circulation Research. 90 (9), 966-973 (2002).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
- Brevetti, L. S., et al. Exercise-induced hyperemia unmasks regional blood flow deficit in experimental hindlimb ischemia. Journal of Surgical Research. 98 (1), 21-26 (2001).
- Ministro, A., et al. Low-dose ionizing radiation induces therapeutic neovascularization in a pre-clinical model of hindlimb ischemia. Cardiovascular Research. 113 (7), 783-794 (2017).
- Pereira, A. R., et al. Therapeutic angiogenesis induced by human umbilical cord tissue-derived mesenchymal stromal cells in a murine model of hindlimb ischemia. Stem Cell Research Therapy. 7 (1), 145 (2016).
- Azaripour, A., et al. A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).
