Ce protocole est utilisé pour isoler les cardiomyocytes auriculaires simples du cœur adulte de souris en utilisant une approche de digestion de morceau. Cette approche est utilisée pour isoler les myocytes auriculaires de droite ou de gauche qui peuvent être utilisés pour caractériser l’électrophysiologie du myocyte auriculaire dans les études de patch-clamp.
Les propriétés électrophysiologiques des myocytes auriculaires affectent considérablement la fonction cardiaque globale. Les altérations des courants ioniques sous-jacents responsables du potentiel d’action peuvent causer des substrats pro-arythmiques qui sous-tendent les arythmies, comme la fibrillation auriculaire, qui sont très répandues dans de nombreuses conditions et états pathotiques. Isoler les cardiomyocytes auriculaires adultes de souris pour l’usage dans des expériences de correction-clamp a considérablement avancé notre connaissance et compréhension de l’électrophysiologie cellulaire dans le myocarde auriculaire sain et dans l’arrangement de la pathophysiologie auriculaire. En outre, des études utilisant des modèles génétiques de souris ont élucidé le rôle d’un vaste éventail de protéines dans la régulation de l’électrophysiologie auriculaire. Ici nous fournissons un protocole détaillé pour l’isolement des cardiomyocytes des appendices auriculaires des souris adultes utilisant une combinaison de digestion enzymatique et de dissociation mécanique de ces tissus. Cette approche donne constamment et de façon fiable des cardiomyocytes auriculaires isolés qui peuvent ensuite être utilisés pour caractériser l’électrophysiologie cellulaire en mesurant les potentiels d’action et les courants ioniques dans le cadre d’expériences de pinces à patch dans le cadre d’un certain nombre d’expériences expérimentales. Conditions.
Les atriums, qui sont les chambres minces murées et basses pressions du cœur qui reçoivent le sang de la veine cavae supérieure et inférieure ainsi que les veines pulmonaires, font partie intégrante de la physiologie cardiaque normale. Comme d’autres régions du cœur, les atriums contiennent un certain nombre de types de cellules, y compris les cardiomyocytes, les fibroblastes, les cellules endothéliales, les cellules musculaires vasculaires lisses, et d’autres. Les myocytes auriculaires sont des cellules électriquement excitables qui jouent un rôle essentiel dans la conduction des signaux électriques à travers le cœur, assurant ainsi une contraction auriculaire appropriée pendant chaque battement cardiaque1. Le dysfonctionnement électrique dans les atriums peut mener à un certain nombre d’arythmies spécifiques auriculaires telles que le flottement auriculaire et la fibrillation auriculaire2,3. Ce sont des arythmies auriculaires très répandues, mais mal comprises, qui mènent à une morbidité et à une mortalité significatives. La fibrillation auriculaire peut se produire en association avec des mutations génétiques, en association avec le vieillissement ou dans le cadre de formes acquises de maladie cardiaque, y compris l’hypertension, l’insuffisance cardiaque et le diabète2,4,5 ,6. Ces conditions peuvent altérer les propriétés électriques des myocytes auriculaires qui peuvent créer un substrat qui augmente la prévalence de l’arythmatèse1,2.
La fonction électrique normale dans les atriums, aussi bien que l’arythmie auriculaire, sont considérablement affectées par la morphologie du potentiel d’action (AP) produit dans les myocytes auriculaires. L’AP auriculaire est généré par l’activité d’un certain nombre de courants ioniques, y compris le courant de sodium (INa, porté par NaV1.5 canaux), le courant de calcium de type L (ICa,L, porté par Cav1.2 et CaV1.3 canaux ), et plusieurs courants de potassium, y compris le courant de rectificateur retardé ultra-rapide de potassium (IKur, porté par KV1.5 canaux), le courant transitoire de potassium extérieur (Ià, porté par KV4.2 et KV4.3 canaux), un courant de potassium d’état régulier (IKss, porté par KV2.1 canaux), et le courant de potassium de rectifier vers l’intérieur (IK1, porté par Kir2.1 canaux)1,7, 8. Bien qu’ils ne jouent pas un rôle majeur dans les atria de souris, les composants rapides et lents du rectifier retardé K– courant (IKr et IKs) contribuent également à la repolarisation AP dans certaines espèces7. Les altérations d’un ou de plusieurs de ces courants ioniques peuvent modifier considérablement les propriétés électriques des myocytes auriculaires, ce qui peut conduire à des arythmies auriculaires. Par exemple, une réduction de INa peut ralentir la vitesse de conduction à travers les atriums en réduisant la vitesse de course AP. D’autre part, une réduction des courants de potassium repolarisantous ou une augmentation de ICa,L ou de la fin INa peut entraîner le développement d’afterdepolarisations qui peuvent déclencher une activité spontanée dans l’atria1, 2,9.
Il est important de reconnaître qu’il existe des différences dans la morphologie AP dans différentes parties du myocarde auriculaire qui sont probablement dues à des différences dans l’expression ou la régulation de ces canaux ioniques sous-jacents. Par exemple, les différences dans la durée AP entre les atrias droite et gauche en association avec les différences dans ià la densité actuelle ont été bien décrits10,11,12,13. En outre, nous avons récemment démontré qu’il y a des modèles distincts de remodelage électrique dans les atria sténopées droites et gauches des souris avec l’hypertension chronique6,14. Le mur postérieur auriculaire droit contient également le nœud sinoatrial, qui a ses propres modèles distincts de morphologie AP et les modèles de tir15. Les propriétés distinctes des myocytes dans chacune de ces différentes parties de l’atrium peuvent être étudiées en détail à l’aide de myocytes isolés de chacune de ces régions.
Il existe différentes approches qui peuvent être utilisées pour isoler les myocytes auriculaires pour les études d’électrophysiologie patch-clamp16. Une possibilité est d’utiliser une approche de perfusion rétrograde où le cœur est cannulated via l’aorte pour la livraison d’enzymes. Bien qu’il s’agisse d’une approche viable, elle peut produire une variabilité dans la qualité des myocytes auriculaires en raison d’incohérences dans la perfusion des atriums. Nous avons adopté une approche de digestion ‘chunk’ pour l’isolement des myocytes auriculaires qui élimine le besoin de perfusion rétrograde du cœur. Notre approche utilise une combinaison de digestion enzymatique et de dissociation mécanique du tissu auriculaire qui donne constamment et de façon fiable un grand nombre de myocytes auriculaires isolés qui conviennent aux études de patch-clamp. Bien que nous décrivions notre approche ici en utilisant le tissu d’appendice auriculaire, l’approche peut être employée sur n’importe quelle région du myocarde auriculaire (c.-à-d., appendices auriculaires droits ou gauches, murs libres, murs postérieurs) que l’investigateur choisit. Cette approche est idéale pour les études de l’électrophysiologie du myocyte auriculaire chez des souris génétiquement modifiées, dans les modèles murins de maladies cardiovasculaires, ou pour l’étude des effets des composés pharmacologiques5,6,17 , 18 ans, états-unis qui , 19.
Notre laboratoire utilise régulièrement ce protocole pour isoler les myocytes auriculaires de souris pour une utilisation dans des expériences de patch-clamp afin d’étudier les effets de différentes formes de maladie cardio-vasculaire, de mutations génétiques, ou de composés pharmacologiques sur le myocyte auriculaire Électrophysiologie. Bien que hautement reproductible, la qualité des données obtenues à partir des myocytes auriculaires isolés dépend de la qualité de l’isolement. En outre, la réintroduction du calcium suivant l’isolement auriculaire de myocyte aura comme conséquence la mort cellulaire pour une population de myocytes isolés dus au paradoxe de calcium16. Par conséquent, l’isolement des myocytes auriculaires viables et de haute qualité à l’aide de cette approche nécessite une pratique et une optimisation à plusieurs points tout au long de l’isolement. Une fois optimisé, on estime qu’entre 70 et 90 % du total des myocytes auriculaires isolés à l’aide de cette approche seront à la fois tolérants au calcium et en forme de tige. Les étapes nécessitant le plus de pratique et d’optimisation sont discutées ci-dessous.
La vitesse et l’efficacité de la dissection auront des effets en aval sur la qualité des cellules isolées. Il est important de prendre le temps de s’assurer que tout le sang est retiré du tissu auriculaire et que les bandes de tissu sont coupées à une taille similaire. Il devrait prendre environ 5 minutes pour enlever l’appendice auriculaire, couper le tissu en bandes, et transférer les bandes de tissu dans le premier tube de la solution modifiée de Tyrode pH 6.9. Cependant, si cette étape prend trop de temps, la qualité du tissu peut être compromise.
Il est également important que les bandes de tissu soient coupées à une taille uniforme dans un isolement et entre les coeurs. Si les bandes de tissu sont trop grandes ou trop petites, ou si elles ne sont pas uniformes dans un isolement, cela peut causer des problèmes pendant la digestion enzymatique et la trituration. C’est parce que les petites bandes seront plus soigneusement digérées et les grandes bandes seront sous-digérées. Il est tout aussi important de tenir compte du génotype et de l’établissement de la maladie à l’étude, car la taille de l’appendice auriculaire peut varier d’un animal à l’autre. Par exemple, les coeurs hypertrophiques ont de plus grands appendices auriculaires comparés aux coeurs sains, et donc l’expérimentateur peut couper plus de bandes dans les coeurs hypertrophiques comparés aux coeurs normaux de taille. En conséquence, l’optimisation de la taille des bandes de tissu coupées et l’application de ces dimensions à chaque appendice auriculaire individuel amélioreront considérablement la reproductibilité des isolements de myocyte entre les conditions expérimentales.
L’équilibre délicat entre la digestion enzymatique et la dissociation mécanique est la clé d’un isolement réussi de myocyte auriculaire utilisant ce protocole. Si le tissu n’est pas suffisamment tourbillonné pendant la digestion enzymatique les bandes de tissu individuelles auront tendance à s’agglutiner et coller ensemble, ce qui limitera l’efficacité de la digestion enzymatique. Si agité trop fréquemment ou vigoureusement, ceci peut endommager le tissu atrial, qui aura comme conséquence l’isolement des cellules non viables. La dissociation mécanique des myocytes auriculaires isolés des bandes de tissu pendant la trituration est l’étape la plus critique à pratiquer et optimiser utilisant cette approche pour isoler les myocytes auriculaires. Si la trituration est trop douce, le rendement cellulaire sera faible. D’autre part, si la trituration est trop sévère, alors une abondance de myocytes non viables sera isolée, et la qualité des données obtenues au cours des expériences de patch-clamp sera compromise. En outre, la composition des atriums peut affecter l’isolement. Par exemple, si le tissu est fibrotique, la digestion enzymatique et les étapes de trituration peuvent devoir être modifiées. Il est donc important de prendre le temps de développer les compétences nécessaires pour obtenir des cellules de haute qualité lors de la trituration qui peuvent être utilisées pour des expériences de patch-clamp.
Comme pour toutes les techniques expérimentales, il y a des limites. Cette technique nécessite une pratique afin d’isoler de façon reproductible des myocytes viables et de haute qualité, ce qui aura un impact sur la faisabilité de toutes les expériences à effectuer à l’aide de ces myocytes. Cette approche est également terminale et les myocytes auriculaires isolés à l’aide de cette approche peuvent être utilisés le jour de l’isolement seulement. Notre laboratoire utilise les cellules dans les 6-7 h de l’isolement.
Cette approche d’isoler les cardiomyocytes auriculaires a plusieurs applications. Par exemple, cette approche peut être modifiée pour isoler les myocytes auriculaires (ainsi que les fibroblastes cardiaques) d’autres espèces, y compris les biopsies des tissus auriculaires humains. En outre, un avantage à utiliser cette méthode de morceau pour l’isolement de myocyte auriculaire (contrairement à la perfusion rétrograde du coeur) est qu’il peut être modifié pour isoler des cardiomyocytes d’autres régions du coeur, telles que le nœud sinoatrial ou d’autres régions spécifiques du myocarde auriculaire, ou englobent toute la région supraventriculaire du cœur. Notre laboratoire utilise des cardiomyocytes auriculaires pour des expériences de patch-clamp pour mesurer les potentiels d’action et les courants ioniques, bien que cette approche ne doit pas être limitée à cette technique. Par exemple, les myocytes isolés peuvent être utilisés pour étudier les altérations des transitoires de calcium et la contractilité dans une variété de milieux expérimentaux. Les cardiomyocytes auriculaires peuvent également être utilisés dans les études d’immunofluorescence pour étudier l’emplacement des protéines ou des structures d’intérêt. En conséquence, cette approche est très polyvalente avec de nombreuses applications possibles.
The authors have nothing to disclose.
Ces travaux sont appuyés par des subventions de fonctionnement des Instituts de recherche en santé du Canada (MOP 93718, 142486) et de la Fondation des maladies du cœur du Canada à R.A. Rose. H.J. Jansen est le récipiendaire d’une bourse postdoctorale Killam.
1, 2-Bis(2-Aminophenoxy)ethane-N, N, N', N'-tetraacetic acid 98% | Sigma | A4926-1G | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate BioXtra, > 99%, from microbial | Sigma | A7699-1G | |
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt > 95%, bacterial | Sigma | A9187-1G | |
Amphocetericin B from Streptomyces sp. ~80% (HPLC), powder | Sigma | A4888-500 MG | |
Bovine serum albumin | Sigma | A3059-50G | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma | 223506-500G | |
Cesium chloride ReagentPlus, 99.9% | Sigma | 289329-100G | |
Cesium hydroxide monohydrate > 99.5% trace metals basis | Sigma | 562505-1KG | |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
Creatine anhydrous | Sigma | C0780 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
DL-Aspartic acid potassium salt | Sigma | A2025-100G | |
Elastase suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS002279 | |
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid >97.0% | Sigma | E4378-25G | |
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate > 95% (HPLC), powder | Sigma | G8877-250MG | |
Heparin 10 000 USP units/10mL | SANDOZ | 10750 | |
HEPES > 99.5% (titration) | Sigma | H3375-500G | |
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate > 99% (HPLC), powder | Sigma | G1501-500G | |
Magnesium sulfate | Sigma | M2643-500G | |
Nifedipine > 98% (HPLC), powder | Sigma | N7634-1G | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate enzymatic, approx 98% | Sigma | P7936-5G | |
Potassium chloride ACS reagent, 99.0-100.5% | Sigma | P3911-500G | |
Potassium hydroxide | EM Science | PX1480-1 | |
Potassium phosphate monobasic | EMD | PX1565-1 | |
Protease from Streptomyces griseus, type XIV, >3.5 units/mg solid, powder | Sigma | P5147-1G | |
Sodium chloride ACS reagent, > 99.0% | Sigma | S9888-2.5KG | |
Sodium hydroxide, pellets, 97+%, A.C.S. reagent | Sigma | 221465-500G | |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | World Precision Instruments Inc | SYLG184 | |
Taurine | Sigma | T0625-100G | |
Tetraethylammonium chloride > 98% (titration) | Sigma | T2265-100G |