Usando microtiter prato Radiolabeling para múltiplo in vivo medições de Escherichia coli (p) ppGpp seguido por cromatografia em camada fina

Resumo

O crescimento de culturas bacterianas radiolabeled em pratos do de microtitulação facilita a amostragem elevada da taxa de transferência que permite testes técnicos e biológicos múltiplos da repetição da abundância da associação do nucleotide, incluindo aquele de (p) ppgpp. Os efeitos das transições de crescimento provocados por fontes de estresse fisiológico, bem como a recuperação do estresse podem ser monitorados.

Resumo

O nucleotídeo (p) ppGpp funciona como um regulador global em bactérias em resposta a uma variedade de estresse físico e nutricional. Tem um início rápido, em segundos, o que leva ao acúmulo de níveis que se aproximam ou excedem os de pools de GTP. Ocasiões de reversão de estresse um rápido desaparecimento de (p) ppGpp, muitas vezes com uma meia-vida de menos de um minuto. A presença de (p) ppGpp resulta em alterações da expressão gênica celular e do metabolismo que contrariam os efeitos nocivos do estresse. As bactérias Gram-negativas e Gram-positivas têm diferentes mecanismos de resposta, mas ambas dependem da (p) concentração de ppGpp. Em todo o caso, há uma necessidade de monitorar simultaneamente muitas culturas bacterianas radioolabeled em intervalos de tempo que podem variar de 10 segundos às horas durante períodos críticos da transição do esforço. Este protocolo aborda este desafio técnico. O método aproveita-se das incubadoras do prato da temperatura-e do Shaker-controlled do de microtitulação que permitem a monitoração paralela do crescimento (absorvância) e a amostragem rápida de culturas uniformemente fosfato-radiolabeled para resolver e quantificar associações do nucleotide por cromatografia em camada delgada em PEI-celulose. Pequenas quantidades de amostra são necessárias para múltiplas repetições técnicas e biológicas de análises. As transições complexas de crescimento, como o crescimento diauxico e as taxas de rotatividade rápida (p) ppGpp, podem ser avaliadas quantitativamente por esse método.

Introdução

O (p) ppgpp segundo mensageiro é um regulador global que modula a expressão de um grande número de genes, incluindo genes para sintetizar ribossomas e aminoácidos^1,2. Embora inicialmente descoberto em Escherichia coli³, (p) ppgpp pode ser encontrado em bactérias gram positivas e Gram negativas, bem como em clorotipados de plantas^4,5. Para e . coli e outras bactérias Gram-negativas, (p) ppgpp interage diretamente com a RNA polimerase em dois sítios diferentes^6,7

Protocolo

1. preparação de mídia

1. Para MOPS (3-(N-morpholino) propanesulfonic ácido) Media²⁵, use 1/10 volume de 10x Mops sais, 1/100 volume de 100x micronutrientes solução, 3 mm fosfato de sódio para culturas overnight ou 0,2 mm fosfato de sódio para a rotulagem uniforme com ³²P, 0,2% de glicose e 1 μg/mL de tiamina (vitamina B1). Adicionar aminoácidos a 40 μg/mL, se necessário.
   1. Para os sais de MOPAS, use 400 mM MOPS, 40 mM Tricine, 0,1 mM FeSO₄, 95 mm NH₄CL, 2,6 mm K₂so₄, 5 ΜM CAcl₂, 10,56 mm MgCl₂e 500 mm NaCl. Adicione os diferentes compo....

Resultados

Em cepas de E. coli K-12, a adição de valina provoca uma inanição endógena de isoleucina, o que resulta em um aumento dos níveis de ppGpp após 5 min³. As células cultivadas em MOPS contendo todos os aminoácidos, exceto para ILV, foram rotuladas com ³²P conforme indicado na Figura 1. Uma vez rotulado, foram adicionados 6 μL de 10 mg/mL de L-valina (100 μg/mL de concentração final) para produzir inanição de isoleucina. As amostras foram colhid.......

Discussão

Conseguir a rotulagem uniforme próxima das pilhas é uma etapa crítica para este protocolo. Portanto, o uso de meios de comunicação definidos, como MOPS ou Tris, é crucial para permitir a variação das concentrações de fosfato de portador e atividade específica. A mídia tamponada por fosfato, como M9 ou mídia A, não pode ser usada. A maioria dos meios indefinidos contêm quantidades variáveis de fosfato, tais como LB, triptona e ácidos casamino. O isótopo de fosfato ³³p é um emissor mais fraco que pode ser substi.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
(NH4)6(MO7)24	Fisher Scientifics	A-674
Filme de autorradiografia	Denville scientific inc.	E3218
CaCl2	J.T.Baker	1-1309
Cloranfenicol	RPI	C61000-25.0
CoCl2	Fisher Scientifics	C-371
CuSO4	J.T.Baker	1843
FeSO4	Fisher Scientifics	I-146
Ácido fórmico	Fisher Biotech	BP1215-500
Glicose	Macron	4912-12
H3BO4	Macron	2549-04
H3PO4	J.T.Baker	0260-02
K2SO4	Sigma	P9458-250G
KH2PO4	Fisher Biotech	BP362-500
L-Valina	Sigma	V-6504
MgCl2	Fisher Scientifics	FL-06-0303
Leitor de microplacas Synergy HT	Biotek	Synergy HT
MnCl2	Sigma	M-9522
MOPS	Sigma	M1254-1KG
Na2HPO4	Mallinckrodt	7892
NaCl	J.T.Baker	3624-01
NaH2PO4	Mallinckrodt	7917
NH4Cl	Sigma	A0171-500G
P-32 radionuclídeo, ácido ortofosfórico em 1 mL de água (5 mCi)	Perkin Elmer	NEX053005MC
Tela de fósforo de armazenamento	Kodak	So230
Thermomixer	Eppendorf	5382000015
Tiamina	Sigma	T-4625
TLC PEI Celulose F	Merk-Millipore	1.05579.0001
Tricine	RPI	T2400-500.0
Typhoon 9400	GE Healthcare
ZnSO4	Fisher Scientifics	Z-68

Gerador de imagens