Nötrofil kütle sitometri analizi için tüm kemik Iliği hazırlanması-Lineage hücreler
Summary
Burada, fare veya insan yüksek boyutlu kitle sitometri için izole taze kemik iliği (BM) işlemek için bir protokol sunuyoruz (zaman-of-Flight ile sitometri, CyTOF) nötrofil-köklü hücrelerin analizi.
Abstract
Bu makalede, tüm BM CyTOF analizi için taze BM nötrofil-Lineage hücreleri korumak için optimize edilmiş bir protokol sunuyoruz. Bu protokolü kullanarak nötrofil-köklü hücrelere odaklanarak hematopoetik sistemi değerlendirmek için bir myeloid-önyargılı 39-antikor CyTOF panelini kullandık. CyTOF sonucu bir açık kaynak boyutlu azaltma algoritması ile analiz edildi, viSNE, ve veri bu protokol sonucunu göstermek için sunuldu. Bu protokole dayanarak yeni nötrofil-köklü hücre nüfusu keşfettik. Yeni tüm BM hazırlık bu protokol 1 için kullanılabilir), CyTOF Analizi tüm BM ‘den tanımlanamayan hücre nüfusu keşfetmek için, 2), lösemi gibi kan bozuklukları olan hastalar için tüm BM kusurlarını araştırmak, 3), optimizasyon yardımcı Yeni tüm BM kullanan floresans aktif akış sitometri protokolleri.
Introduction
Son yıllarda, sitometri yöntemleri BM ‘de hematopoetik sistemi araştırmak için güçlü bir araçtır. Bu yöntemler arasında floresan aktif akış sitometri ve ağır metal etiketli antikorlar kullanarak yeni CyTOF yöntemi yer aldı. Benzersiz yüzey Marker ifade profillerinin tanımlanması ile heterojen bir biyolojik örnekten birçok hücre türünün keşiflerine yol açtı. Daha fazla kanal ile ilişkili olan artan spektrumlu çakışmalar, floresan aktif akış sitometri uygulamalarında daha yüksek veri doğruluğunu sağlar. Bu nedenle, floresan aktif akış sitometri analizi için ilgi hücre nüfusunu zenginleştirmek amacıyla istenmeyen hücreler rutin olarak kaldırılır. Örneğin, Ly6G (veya gr-1) ve CD11b olgun miyeloid hücre işaretçileri olarak kabul edilir ve Ly6G+ (veya gr-1+) ve CD11b+ hücreler rutin olarak BM örneklerinden kaldırılır ve akış sitometri analizinden önce Manyetik Zenginleştirme kitleri kullanılarak hematopoetik kök ve progenitör hücreler (hspcs) veya bir döküm kokteyl kanalı1,2,3bu işaretçileri birleştirerek. Diğer bir örnek ise nötrofiller, immünolojik çalışmalar için periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) zenginleştirmek için insan kanı örneğinden rutin olarak kaldırılmalıdır. Tüm kemik iliği fare veya insan izole, ancak, nadiren sitometri analizi için bozulmamış incelenmiştir.
Son zamanlarda, cytof hematopoetik sistemi araştırmak için devrimci bir araç haline gelmiştir4,5,6. CyTOF ile fluorophore etiketli antikorlar ağır eleman muhabiri etiketli antikorlarla değiştirilir. Bu yöntem, spektrum örtüşme endişe olmadan aynı anda 40 üzerinde işaretçileri ölçümü için izin verir. Önceden tükenme adımları veya bir döküm kanalı olmadan bozulmamış biyolojik numunenin analizini sağladı. Bu nedenle, geleneksel 2-b akış sitometri grafiklerden yüksek içerik boyutallık ile hematopoetik sistemi kapsamlı bir şekilde görebilirsiniz. Tükenme veya gating süreci sırasında geçmişte atlanacak hücre nüfusu artık cytof4,5tarafından oluşturulan yüksek boyutlu verilerle ışığa getirilebilir. Hemopoetik sistemde 39 parametreleri aynı anda ölçen bir antikor paneli tasarladık, miyeloid astar7‘ ye odaklanarak. Geleneksel akış sitometri verilerine kıyasla, CyTOF tarafından oluşturulan eşsiz tek hücreli yüksek boyutlu verilerin yorumlama ve görselleştirilmesi zordur. Hesaplamalı Bilim adamları, yüksek boyutlu veri kümeleri görselleştirme için dimensionality azaltma teknikleri geliştirdik. Bu yazıda, CyTOF verilerini analiz etmek ve yüksek boyutlu yapısı koruyarak 2 boyutlu harita üzerinde yüksek boyutlu sonuç sunmak için t-dağıtılmış Stochastic komşu katıştırma (t-SNE) tekniği kullanır algoritma, viSNE, kullanılan veri8,9,10. TSNE arsa, benzer hücreler alt kümeleri içine kümelenmiş ve renk hücrelerin özelliğini vurgulamak için kullanılır. Örneğin, Şekil 1 ‘ de miyeloid hücreler, 33 yüzey işaretleyicilerinin ifade desenlerinin benzerliklerini temel alarak birkaç hücre alt setine dağıtılır (Şekil 1)4. Burada daha önce bildirilen 39-Marker CyTOF panel viSNE analiz tarafından fare kemik iliği araştırıldı7. CyTOF verilerimizin viSNE analizi, HSPC (CD117+) ve nötrofil (Ly6G+) özelliklerini (Şekil 2)7gösteren tanımlanamayan bir hücre popülasyonunu ortaya koydu.
Sonuç olarak, CyTOF analizi için taze tüm kemik iliği işlemek için bir protokol sunuyoruz. Bu yazıda, bir örnek olarak fare kemik iliği kullandık, bu protokol de insan kemik iliği örneklerini işlemek için kullanılabilir iken. İnsan kemik iliği örneklerine özgü detaylar da protokolde belirtilmiştir. Bu protokolün avantajı, tüm kemik iliğinde nötrofil-köklü hücreleri korumak için optimize edilmiş olan inkübasyon süresi ve sıcaklığı gibi ayrıntıları içerdiğinden, tüm kemik iliği üzerinde soruşturma sağlamak. Bu protokol floresans aktif akış sitometri uygulamalarında da kolayca değiştirilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Son yıllarda, hücresel sırların ve heterojenlik1,2,3çalışma için ana yöntem olarak floresans bazlı akış sitometri kullanılmıştır. Akış sitometri çok boyutlu veriler sağlasa da, bu yöntem Parametreler ve spektral örtüşme seçenekleriyle sınırlıdır. Akış sitometri zayıflığının üstesinden gelmek için biz, bu nedenle, dedektör kanalları veya hücrelerin otofloresans arasındaki çapraz ortadan …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kitle sitometri prosedüründe yardım almak için LJı Flow sitometri çekirdeğine teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma NıH hibe R01HL134236, P01HL136275 ve R01CA202987 (tüm C. C. H) ve ADA7-12-MN-31 (04) (C.C.H. ve Y. P. Z) tarafından destekleniyordu.
Materials
| CyTOF Antibodies (mouse) | |||
| Anti-Mouse CD45 (Clone 30-F11) -89Y | Fluidigm | Cat# 3089005B | |
| Anti-Human/Mouse CD45R/B220 (Clone RA36B2)-176Yb | Fluidigm | Cat# 3176002B | |
| Anti-mouse CD105 (Clone MJ7/18)-Purified | Biolegend | Cat# 120402; RRID:AB_961070 | |
| Anti-mouse CD115 (CSF-1R) (Clone AFS98)-Purified | Biolegend | Cat# 135502; RRID:AB_1937293 | |
| Anti-Mouse CD117/c-kit (Clone 2B8)-166Er | Fluidigm | Cat# 3166004B | |
| Anti-mouse CD11a (Clone M17/4)-Purified | Biolegend | Cat# 101101; RRID:AB_312774 | |
| Anti-Mouse CD11b (Clone M1/70)-148Nd | Fluidigm | Cat# 3148003B | |
| Anti-Mouse CD11c (Clone N418)-142Nd | Fluidigm | Cat# 3142003B | |
| Anti-mouse CD127 (IL-7Rα) (Clone A7R34)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD150 (Clone TC1512F12.2)-167Er | Fluidigm | Cat# 3167004B | |
| Anti-mouse CD16.2 (FcγRIV) (Clone 9E9)-Purified | Biolegend | Cat# 149502; RRID:AB_2565302 | |
| Anti-Mouse CD162 (Clone 4RA10 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 557787; RRID:AB_647340 | |
| Anti-mouse CD169 (Siglec-1) (Clone 3D6.112)-Purified | Biolegend | Cat# 142402; RRID:AB_10916523 | |
| Anti-mouse CD182 (CXCR2) (Clone SA044G4)-Purified | Biolegend | Cat# 149302; RRID:AB_2565277 | |
| Anti-mouse CD183 (Clone CXCR3-173)-Purified | Biolegend | Cat# 126502; RRID:AB_1027635 | |
| Anti-mouse CD335 (NKp46) (Clone 29A1.4)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 137625; RRID:AB_2563744 | |
| Anti-mouse CD34 (Clone MEC14.7)-Purified | Biolegend | Cat# 119302; RRID:AB_345280 | |
| Anti-mouse CD41 (Clone MWReg30)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 133919; RRID:AB_2565433 | |
| Anti-Mouse CD43 (Clone S11)-146Nd | Fluidigm | Cat# 3146009B | |
| Anti-Mouse CD48 (Clone HM48.1)-156Gd | Fluidigm | Cat# 3156012B | |
| Anti-mouse CD62L (Clone MEL-14)-MaxPar Ready | ThermoFisher | Cat# 14-1351-82; RRID:AB_467481 | |
| Anti-mouse CD71 (Clone RI7217)-Purified | Biolegend | Cat# 113802; RRID:AB_313563 | |
| Anti-mouse CD90 (Clone G7)-Purified | Biolegend | Cat# 105202; RRID:AB_313169 | |
| Anti-Mouse F4/80 (Clone BM8)-159Tb | Fluidigm | Cat# 3159009B | |
| Anti-mouse FcεRIα (Clone MAR-1)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 134321; RRID:AB_2563768 | |
| Anti-mouse GM-CSF (MP1-22E9 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 554404; RRID:AB_395370 | |
| Anti-Mouse I-A/I-E (Clone M5/114.15.2)-174Yb | Fluidigm | Cat# 3174003B | |
| Anti-Mouse Ki67 (Clone B56 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 556003; RRID:AB_396287 | |
| Anti-Mouse Ly-6A/E (Sca-1) (Clone D7)-169Tm | Fluidigm | Cat# 3169015B | |
| Anti-Mouse Ly6B (Clone 7/4)-Purified | abcam | Cat# ab53457; RRID:AB_881409 | |
| Anti-mouse Ly-6G (Clone 1A8)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 127637; RRID:AB_2563784 | |
| Anti-Mouse NK1.1 (Clone PK136)-165Ho | Fluidigm | Cat# 3165018B | |
| Anti-Mouse Siglec-F (Clone E50-2440 (RUO))-Purified | BD Biosciences | Cat# 552125; RRID:AB_394340 | |
| Anti-Mouse TCRβ (Clone H57-597)-143Nd | Fluidigm | (Clone H57-597)-143Nd | |
| Anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Clone TER-119)-MaxPar Ready | Biolegend | Cat# 116241; RRID:AB_2563789 | |
| Chemicals, Peptides and Recombinant Proteins | |||
| Antibody Stabilizer | CANDOR Bioscience | Cat# 130050 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | Cat# A4503 | |
| Cisplatin-194Pt | Fluidigm | Cat# 201194 | |
| eBioscience 1X RBC Lysis Buffer | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | Cat# 00-4333-57 | |
| EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | Cat# 201078 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | ThermoFisher | Cat# AM9260G | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | Cat# FB-02 | |
| HyClone Phosphate Buffered Saline solution | GE Lifesciences | Cat#SH30256.01 | |
| Intercalator-Ir | Fluidigm | Cat# 201192B | |
| MAXPAR Antibody Labeling Kits | Fluidigm | http://www.dvssciences.com/product-catalog-maxpar.php | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | Cat# 158127 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | Cat# S2002 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# X100 | |
| Trypsin EDTA 1X | Corning | Cat# 25-053-Cl | |
| Experimental Model: Organism/Strains | |||
| Mouse: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | Stock No: 000664 | |
| Software Alogrithm | |||
| Bead-based Normalizer | Finck et al., 2013 | https://med.virginia.edu/flow-cytometry-facility/wp-content/uploads/sites/170/2015/10/3_Finck-Rachel_CUGM_May2013.pdf | |
| Cytobank | Cytobank | https://www.cytobank.org/ | |
| Cytofkit v1.r.0 | Chen et al., 2016 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cytofkit.html | |
| t-SNE | van der Maaten and Hinton, 2008 | https://cran.r-project.org/web/packages/Rtsne/index.html | |
Referências
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Iwasaki, H., Akashi, K. Myeloid lineage commitment from the hematopoietic stem cell. Immunity. 26, 726-740 (2007).
- Manz, M. G., Miyamoto, T., Akashi, K., Weissman, I. L. Prospective isolation of human clonogenic common myeloid progenitors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 11872-11877 (2002).
- Becher, B., et al. High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system. Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).
- Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nature Methods. 13, 493-496 (2016).
- Zhu, Y. P., et al. Identification of an Early Unipotent Neutrophil Progenitor with Pro-tumoral Activity in Mouse and Human Bone Marrow. Cell Reports. 24, 2329-2341 (2018).
- Van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizing High-Dimensional Data Using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9, 2579-2605 (2008).
- Amir, E. A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nature Biotechnology. 31, 545-552 (2013).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing data using t-SNE. Journal of Machine Learning Research. 9 (85), 2579-2065 (2008).
- Cloos, J., et al. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. Journal of Visualized Experiment. 133, 56386 (2018).
- Bendall, S. C., Nolan, G. P., Roederer, M., Chattopadhyay, P. K. A deep profiler’s guide to cytometry. Trends in Immunology. 33, 323-332 (2012).
- Ley, K., et al. Neutrophils: New insights and open questions. Science Immunology. 3 (30), 4579 (2018).
- Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. Heterogeneity of neutrophils. Nature Reviews in Immunology. , (2019).
