Avaliando o microambiente do tumor da permeabilidade vascular entrada-negociada metástase associada com a disseminação da pilha do cancro usando a imagem latente intravital e a análise fixa do tecido
Summary
Nós descrevemos dois métodos para avaliar a permeabilidade vascular transiente associada com o microambiente do tumor da função da entrada da metástase (TMEM) e da intravasação da pilha de cancro usando a injeção intravenosa do dextrano high-molecular do peso (155 kDa) nos ratos. Os métodos incluem a imagem latente intravital em animais vivos e a análise fixa do tecido usando a imunofluorescência.
Abstract
A causa mais comum de mortalidade relacionada ao câncer é a metástase, um processo que requer a disseminação de células cancerosas do tumor primário para sítios secundários. Recentemente, nós estabelecemos que a disseminação da pilha de cancro no cancro da mama preliminar e em locais metastáticos no pulmão ocorre somente nas entradas chamadas MicroEnvironment do tumor da metástase (TMEM). O número da entrada de TMEM é prognóstico para o retorno distante da doença metastática em pacientes do cancro da mama. As portas de tmem são compostas de uma célula cancerosa que expresse sobre-expressa a proteína reguladora de actina Mena no contato direto com um macrófago perivascular, pró-angiogênicos que expresse níveis elevados de TIE2 e de VEGF, onde ambas estas pilhas são amarradas firmemente a um sangue célula endotelial do vaso. As células cancerosas podem intravasate através das entradas de TMEM devido à permeabilidade vascular transiente orquestradas pela atividade comum do macrófago TMEM-associado e da célula cancerosa TMEM-associada de Mena-expressando. Neste manuscrito, nós descrevemos dois métodos para a avaliação da permeabilidade vascular transiente TMEM-negociada: imagem latente intravital e a imunofluorescência fixa do tecido. Embora ambos os métodos tenham suas vantagens e desvantagens, combinar os dois pode fornecer as análises as mais completas da permeabilidade vascular tmem-negociada assim como pré-requisitos microambientais para a função de tmem. Desde o processo metastático no cancro da mama, e possivelmente outros tipos de cancro, envolve a disseminação da pilha do cancro através das entradas de TMEM, é essencial empregar métodos bem estabelecidos para a análise da atividade da entrada de TMEM. Os dois métodos descritos aqui fornecem uma abordagem abrangente para a análise da atividade de entrada de TMEM, seja em animais ingênuos ou farmacologicamente tratados, o que é de suma importância para os ensaios pré-clínicos de agentes que impedem a célula cancerosa disseminação via TMEM.
Introduction
Os avanços recentes em nossa compreensão da metástase do cancro descobriram que a transição epithelial-à-mesenchymal (EMT) e a indução de uma subpopulação migratória/invasora da pilha de cancro não são, por si só, suficientes para a disseminação hematógena 1. indeed, pensou-se previamente que as pilhas de cancro se por metástese intravasate através da totalidade do endotélio cancro-associado como o neovasculature do tumor é caracterizada frequentemente pela baixa cobertura do pericyte, e como tal, é altamente permeável e instável2,3,4. Embora altamente sugestivo de funções defeituosas dentro do tumor, as modificações vasculares durante a carcinogénese não fornecem a evidência por se que as pilhas do tumor podem penetrar vasos sanguíneos facilmente e em uma forma descontrolada. Introspecções dos estudos intravital da imagem latente (IVI), em que as pilhas do tumor Fluorescently-são etiquetadas e o vasculatura é etiquetado através da injeção intravenosa de pontas de prova fluorescentes (tais como o dextrano ou pontos do Quantum), mostra que, quando os vasos do tumor forem uniformemente permeável ao dextranos de baixo peso molecular (por exemplo, 70 kD), o dextranos de alto peso molecular (155 kD) e as células tumorais podem atravessar o endotélio apenas em sítios especializados de intravasação que estão preferencialmente localizados no ponto de ramificação vascular5, 6 anos de , as análises 7. immunohistochemical (IHC) usando modelos animais e o material paciente-derivado humano mostraram que estes locais são “doorways” que se especializam em regular a permeabilidade vascular, localmente e transientemente, fornecendo uma breve janela de oportunidade para que as células cancerosas migratórias/invasivas entrem na circulação. Estas portas são chamadas “microambiente do tumor da metástase” ou “tmem”, e, completamente expectedly, sua densidade correlaciona com um risco aumentado de desenvolver a doença metastática em pacientes do cancro da mama8,9, a 10.
Cada porta TMEM consiste em três tipos distintos de células: um macrófago perivascular, uma célula tumoral sobreexpressando a proteína actina-reguladora de mamíferos ativada (Mena), e uma célula endotelial, tudo em contato físico direto uns com os outros1, 5,9,10,11,12,13. O evento-chave para a função de TMEM como uma entrada de intravasação é a liberação localizada do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) para o vaso subjacente pelo macrófago perivascular14. VEGF pode interromper junções neutralizantes entre as células endoteliais15,16,17,18,19, um fenômeno que resulta em vazamento vascular transitório, também conhecida como permeabilidade “estourando” como descrito em estudos de IVI 5. Os macrófagos de tmem foram mostrados para expressar o receptor da tirosina quinase TIE2, que é exigido para a função de tmem VEGF-negociada e homing destes macrófagos ao Niche perivascular5,20,21 , 22. além de regular a disseminação e a metástase de células cancerosas, TIE2+ macrófagos demonstraram ser reguladores centrais da angiogênesetumoral 21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. Como tal, TIE2+ macrófagos representam um constituinte crítico do microambiente tumoral e o principal regulador da cascata metastática.
Para conceituar melhor a permeabilidade vascular mediada por TMEM (ou seja, “estourando”), é muito importante distingui-la de outros modos de permeabilidade vascular que não estão associados à dissolução de junções endoteliais de células celulares. Em um endotélio intacto (um cujas junções apertadas e aderens não são interrompidas), existem três tipos principais de permeabilidade vascular: (a) pinocitose, que pode, ou não, ser acoplada à transcitose do material ingerido; (b) transporte de material através de fenestrae endotelial; e (c) transporte de material através da via paracelular, que é regulado por junções apertadas endoteliais15,16,17,18,19,32 , 33 , 34. embora desregulamentado em muitos tumores, os modos acima mencionados da permeabilidade vascular foram descritos na maior parte no contexto da fisiologia e do Homeostasis normais do tecido, os extremos de que são os tecidos com uma ou outra permeabilidade limitada ( por exemplo, barreira hematoencefálica, barreira sangue-testis), ou permeabilidade abundante (por exemplo, capilares fenestrados do aparelho glomerular renal)34,35,36,37.
Usando a imagem latente intravital do multifotônica e a microscopia multiplexada da imunofluorescência, nós podemos distinguir entre a permeabilidade vascular tmem-negociada (“estourando”) e outros modos da permeabilidade vascular em tumores do peito. Para conseguir isto, nós realizamos uma única injeção intravenosa de um peso elevado-molecular, sonda fluorescently-etiquetada nos ratos. Eventos de ruptura espontânea podem ser capturados usando imagens intravitais em camundongos vivos; ou alternativamente, o extravasamento da sonda pode ser quantificado por estudos de colocalização com vasculatura sanguínea (por exemplo, CD31+ ou Endomucin+) e portas tmem usando microscopia de imunofluorescência. Os protocolos apresentados aqui descrevem ambas as técnicas, que poderiam ser usadas independentemente ou conjuntamente umas com as outras.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, nós esboçamos dois protocolos que podem ser aplicados para visualizar e quantificar um tipo específico de permeabilidade vascular que esteja atual em entradas de TMEM e esteja associado com o rompimento de junções vasculares apertadas e dos aderens. Este tipo de permeabilidade vascular é transiente e controlado pelo complexo tripartida da pilha de tmem, como explicado acima de5. A capacidade de identificar e quantificar a permeabilidade vascular associada à TMEM é crucial para a aval…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer à unidade de imagem analítica (AIF) no Albert Einstein College of Medicine para suporte de imagem. Este trabalho foi apoiado por subsídios do NCI (P30CA013330, CA150344, CA 100324 e CA216248), o SIG 1S10OD019961-01, o centro de Biophotonics Gruss-Lipper e seu programa de imagem integrada, e Ruth L. Kirschstein de Montefiore T32 capacitação de cirurgiões para o estudo do microambiente tumoral (CA200561).
A GSK co-escreveu o manuscrito, realizou imagens para a figura 1C e 3B, desenvolveu protocolo de análise de tecido fixo, analisou e interpretou todos os dados; O JMP co-escreveu o manuscrito e realizou a cirurgia e a imagem intravital para a figura 1B, 2C e 3a; LB & AC realizou a cirurgia e a imagem intravital para a figura 2B; O RJ realizou a cirurgia e a imagem intravital para a figura 2a; JSC co-escreveu o manuscrito e analisou e interpretou todos os dados; Mho co-escreveu o manuscrito e analisou e interpretou todos os dados; e de executou a cirurgia e a imagem latente intravital para a Figura 2D, co-escreveu o manuscrito, desenvolveu a análise fixa do tecido e os protocolos intravital da imagem latente, e analisou e interpretou todos os dados.
Materials
| Anti-rabbit IgG (Alexa 488) | Life Technologies Corporation | A-11034 | |
| Anti-rat IgG (Alexa 647) | Life Technologies Corporation | A-21247 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Citrate | Eng Scientific Inc | 9770 | |
| Cover Glass Slips | Electron Microscopy Sciences | 72296-08 | |
| Cyanoacrylate Adhesive | Henkel Adhesive | 1647358 | |
| DAPI | Perkin Elmer | FP1490 | |
| Dextran-Tetramethyl-Rhodamine | Sigma Aldrich | T1287 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Endomucin (primary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | sc-65495 | |
| Enrofloxacin | Bayer | 84753076 v-06/2015 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| Fish Skin Gelatin | Fisher Scientific | G7765 | |
| Insulin Syringe | Becton Dickinson | 309659 | |
| Isofluorane | Henry Schein | NDC 11695-6776-2 | |
| Matrigel | Corning | CB40234 | Artificial extracellular matrix |
| Needle (30 G) | Becton Dickinson | 305128 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies Corporation | PBS | |
| Polyethylene Tubing | Scientific Commodities Inc | BB31695-PE/1 | |
| Pulse Oximeter | Kent Scientific | MouseOx | |
| Puralube Vet Ointment | Dechra | NDC 17033-211-38 | |
| Quantum Dots | Life Technologies Corporation | Q21561MP | |
| Rubber | McMaster Carr | 1310N14 | |
| TMR (primary antibody) | Invitrogen | A6397 | |
| Tween-20 | MP Biologicals | TWEEN201 | |
| Xylene | Fisher Scientific | 184835 |
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