Summary
在这里，我们提出了一个协议，描述了一个简化的方法，用于有效生成质粒，同时表达CRISPR酶和相关的单导RNA（sgRNA）。哺乳动物细胞与这种sgRNA/CRISPR载体的共转染，以及检查双链断裂修复的双荧光素酶报告器载体，可以评估敲除效率。
Abstract
虽然效率很高，但由CRISPR酶对基因组位点进行修饰需要事先生成目标位点特有的sgRNA。这项工作描述了导致构建高效 sgRNA 载体的关键步骤，该策略允许在 DNA 测序之前通过 PCR 有效检测正菌落。由于使用CRISPR系统进行有效的基因组编辑需要高效的sgRNA，因此必须预选候选sgRNA目标，以节省时间和精力。开发了双荧光素酶报告机系统，通过检查通过单股退火检查双链断裂修复来评估敲除效率。在这里，我们使用这个记者系统从候选sgRNA载体中选取首选的xCas9/sgRNA靶点进行特定基因编辑。概述的协议将在10天内提供首选的sgRNA/CRISPR酶载体（从适当设计的寡核苷酸开始）。
Introduction
CRISPR sgRNA由20核苷酸序列（原空间）组成，是对基因组靶序1，2的补充。虽然效率很高，但CRISPR/Cas系统修改给定基因组位点的能力需要生成携带目标位点独一无二的高效sgRNA的载体。本文介绍了生成该 sgRNA 载体的关键步骤。
对于使用CRISPR/Cas系统成功编辑基因组，使用高效的sgRNA是一个关键的先决条件3，4，5。由于用于基因组编辑的工程核酸酶在不同靶点1上表现出不同的效率，因此为了节省时间和精力，有必要预先选择候选sgRNA靶点。已开发出双荧光素酶报告系统，通过检查双链断裂修复通过单股退火3，10来评估淘汰效率。在这里，我们使用这个记者系统从不同的候选sgRNA载体中选择一个首选的CRISPR sgRNA靶点，这些载体设计用于特定的基因编辑。此处所述的协议已在我们的小组和协作实验室中实施，以生成和评估 CRISPR sgRNA。
以下协议总结了如何通过网络软件设计出合适的sgRNA。选择合适的 sgRNA 后，我们描述了获取所需寡核苷酸的不同步骤，以及将配对寡核苷酸插入 pX330-xCas9 表达载体的方法。我们还提出了一种基于这些序列的连体到预消化的表达向量（步骤2-10，图1A）的基础上组装sgRNA表达和双荧光 素酶报告器向量的方法。最后，我们描述了如何分析每个sgRNA的DNA切割效率（步骤11-12）。
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Protocol
1. sgRNA寡核苷酸设计
- 使用在线工具（如 Cas-Designer 在线工具（http://www.rgenome.net/cas-designer/） 设计 sgRNA。基于使用的 Cas9，PAM 序列非常重要。对于 xCas9，相关的 PAM 序列是 NG，前引用的 Cas-Designer 在线工具可以生成 xCas9 相关的 sgRNA。
- 使用 sgRNA 设计工具，这些工具包含目标上和目标外预测 （http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design）11的算法。首选分数为 0.2 或更高。
- 选择多达3个基因编辑目标进行最佳筛选（例如，T1、T2和T3是为绵羊DKK2 exon 1基因靶向设计的[表1]）。
2. 寡核苷酸改性
- 要修改 sgRNA 寡核苷酸，请删除 3'-NG 原空间器相邻图案 （PAM），保留原空间器序列（例如，T1 的起始序列：TGCCTCTCTCTGGGC [20 nt]）。
- 将五核苷酸CACCG添加到寡头的5'端。
注：在连接pX330-xCas9骨架时，此序列将包含U6启动子激励sgRNA转录的3'端。阵列"CACC"保证寡头与BbSI消化的pX330-xCas9质粒的悬伸相匹配。基"G"是RNA聚合酶III启动子的前提，保证了sgRNA转录的有效启动（例如，将5'-CACCG阵列附在T1的原空间器上，实现T1-F：CACCGGCTCTCTCTGGCCC[25 nt]）。21 nt gRNA的裂解效率与20 nt gRNA1、12、13、14的裂解效率有显著差异。通常建议使用 20 nt 与 5'-G 通过生成较短的原型空间， 如果这是不可能的， 那么 21 nt 与额外的 5' -G 可以使用. - 创建原空间序列的反向补码 （rc）。
注意：例如，T1 原型空间器的 rc 是 GCGGCCAGTAGGAGCA （20 nt）。 - 将 AAAC 追加到 rc 原空间器序列的 5' 端。将附加 C 追加到 rc 原型空间器的 3'端。
注："AC"序列确保寡核苷酸适合克隆到BbSI消化的pX330-xCas9质粒中。3'端的附加"C"对于上述 sgRNA 转录的启动"G"至关重要（例如，AAACGCGCCAGTAGGAGAGGC [25 nt] 是 T1 rc 原生空间器的最终寡核苷酸序列）。 - 订购寡核苷酸。
3. 寡核苷酸退火
- 在双蒸馏水中稀释冻干寡核苷酸，最终浓度为10μM（ddH2O）。
- 将前向和反向寡核苷酸混合在薄壁 PCR 管中，在不添加任何额外缓冲液的情况下，将 1：1 比（例如，每个 20 μL）与主菜混合。
- 在95°C下孵育混合物5分钟，然后将温度降到72°C10分钟。在室温 （RT） 下进行冷却，包括简单地从 PCR 机器上取出样品并放置在 RT。
注：没有必要磷化寡核苷酸混合物，以促进结扎。
4. sgRNA/CRISPR载体消化
- 在37°C下，1μg的选定pX330-xCas9载体与 BbsI（每1μg质粒10单位酶）的消化1μg，为2小时（图2）。在总体积为50μL、含有5μL的10倍消化缓冲液和蒸馏水中进行pX330-xCas9 sgRNA表达载体的消化，以达到最终体积。
- 通过从 10 V/cm 以下的 2% agarose 凝胶中带中提取来净化消化的载体，然后使用商业凝胶提取套件使用硅胶柱进行净化。
5. 退火 sgRNA 寡核苷酸与表达载体的连结
- 将退火的 sgRNA 寡核苷酸（步骤 4 中混合物的 5 μL）与 BbsI 消化的 pX330-xCas9 载体（纯化，100 ng）混合。
- 加入1 μL的连体和1 μL的10x连体缓冲液。
- 加入适当体积的蒸馏水，高达 10 μL。
- 在4°C孵育过夜。
6. 称职的细胞转换
- 从 -80°C 的储存中拿出大肠杆菌 DH5+ 称职细胞，并在冰上解冻。
- 将 5 μL 的结扎混合物加入 50 μL 的称职大肠杆菌 DH5°中，并将混合物放在冰上 30 分钟。
- 热冲击混合物在42°C90 s。
- 在冰上休息2分钟。
- 在 37 °C 下，在 500 μL LB 介质中回收旋转摇床上的培养基 1 小时。
- 板200μL培养在安西林抗LB加糖板和孵育过夜在37°C。
7. 通过 PCR 识别正确的重组质粒
- 从 LB 板中选择 5 到 10 个细菌菌落，并使用每个菌落接种一个 1.5 mL 管，其中含有 1 mL LB 介质，含有 60 mg/mL 安西林。
- 在旋转摇床上孵育管2-3小时。
- 使用sgRNA寡核苷酸的特定底转对进行正确重组质粒的检测[例如，T1 sgRNA表达载体构造的正向底转（T1-F）：CACCGTGCTCTCTCTCCGCCC，反向底转（BbsI-R）：AAAGTCTTTGCTCT，产生287bp安培（图3）。
- 准备 PCR 混合物 （表 2）
- 使用以下PCR循环条件：95°C，5分钟用于变性前;30 个周期 95 °C 表示变性 30 s，60°C 表示 30 s，72°C 表示 30 s 的扩展。30 个循环完成后，在 72 °C 下加热 5 分钟，执行最终延长步骤。
- 在 10 V/cm 以下的 2% 的阿加罗斯凝胶上运行 PCR 产品。大小合适的波段[例如，287 bp] 被视为正。
8. 验证 sgRNA 表达质粒序列
- 使用反向底明 BBSI-R（参见步骤7.3）通过 Sanger测序 15 验证 PCR 阳性菌落的序列。这种底向在 sgRNA 寡性插入器下游的站点。构建了含有原空间器TCCTCTCTGGCCGGGGGG和xCas9的pX330-xCas9-T1表达sgRNA序列。
- 使用正底图 T1-F 对正菌落进行测序。转发者无法提供 sgRNA 寡转位插入位周围的站点的完整序列信息，因为测序底转后 30-50 bp 片段无法准确读取。
9. 双荧光素分析载体的构造
- 合成含有sgRNA靶目标的300-500bpDNA片段，并通过双消化将2个荧光素酶报告器载体合成为双荧光素酶报告器载体[例如，亚端440 bp羊DKK2 exon1片段，通过使用双消化与AscI和Salu，17，结果pSSA-双-DKK2]。
- 合成含有sgRNA目标的300-500bpDNA片段。请注意，DNA片段的序列必须是基因组序列的一部分，可以从NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）或相关参考文献获取。
- 选择合适的双荧光素酶处理器载体，如pSSA-双16、17（或两个分别表示萤火虫荧光酶和瑞尼拉荧光酶的载体），然后用两个内端图（如AcI和Saly）消化该载体和上述DNA片段。
- 最后用T4 DNA Ligase将这两个片段分，形成pSSA-双目标。双消化和结扎的细节分别显示在 表3 和 表4中。值得一提的是，报告载体应放大在稳定的细菌菌株（如 Top10），建议培养较低的旋转速度（通常不超过200转/秒），以避免DNA重组。
10. 细胞转染
- 为上述载体提取无内毒素质粒。使用合适的仪器评估质粒的纯度和浓度。对于这些质粒，建议最终浓度不低于500纳克/μL，在吸水260/280纳米（A260/A280）时纯度为1.7-1.9。
- 使用 24 井板时，与质粒比例相等（例如，pX330-xCas9-T1：pSSA-双DKK2=1：1，每次复制的 0.5 μg 质粒）共同感染适当的细胞系，如 PIEC18。 使用空矢量（如 pX330-xCas9）作为负控件。
- 转染前一天，24井培养板中的板细胞密度为2×105 细胞/井。当细胞达到60-80%的汇合时，它们就可以进行转染。
- 在转染时间点之前，尽可能去除上流液，并轻轻地为每井添加0.5 mL的新鲜介质。
- 以1：25的比例稀释DMEM介质中的转染试剂，混合均好。
- 在25μL的DMEM培养基中稀释0.5μg的DNA，然后加入1微升的P3000试剂，制备DNA的主混合。
- 将稀释的脱氧核糖核酸加入每管稀释的转染试剂（1：1比）。
- 在室温下孵育10~15分钟。
- 向细胞中加入50μL的DNA脂质复合物。
- 在37°C下孵育细胞24小时。 然后，分析转染细胞，如步骤11。
11. 双荧光素酶检测
- 通过将 1 体积 5 倍 PLB 添加到 4 体积蒸馏水中并混合好，准备足够数量的 1x 无源解液缓冲液 （PLB）。
- 在24孔培养板中培养的细胞的被动解解。
- 从培养细胞中去除生长介质，轻轻涂抹足够量的磷酸盐缓冲盐水（PBS）来清洗培养容器的表面。短暂旋转容器以去除分离的细胞和残余生长介质。在应用 PLB 试剂之前，请完全去除冲洗溶液。
- 将 100 μL 的 1x PLB 分配到每个培养井中，以完全覆盖细胞单层。让文化板站立20分钟。
- 将落酸转移到管子或小瓶中，以进行进一步处理或储存。
- 在提供的荧光素酶测定缓冲液的10 mL中重新分配提供的冻干化荧光素酶测定基质，准备荧光素酶测定试剂（LAR）。
- 准备足够的体积，以执行所需的双荧光素酶报告器检测（每个测定100μL试剂）。在玻璃或硅化聚丙烯管中，将 1 体积的 50 倍止板基板添加到 50 卷止损缓冲液中。
- 双荧光素分析器（DLR）测定
- 程序亮度计提供 2 秒的预读延迟，然后是 10 秒的测量周期。
- 将100μL的荧光素酶测定试剂预发到适当数量的发光度管中，以完成所需的DLR测定数量。
- 小心地将高达 20 μL 的细胞含盐转移到含有 LAR 的发光计管中;通过移液混合 2 或 3 次。将管子放在发光计中并启动读数。
- 从发光仪上取下样品管，加入100μL的止损试剂和涡流，短暂混合。更换发光计中的样品，然后开始读取。
- 记录与萤火虫荧光酶活性正常化的瑞尼拉荧光酶活性，即屏幕上显示的比例的倒数。
- 丢弃反应管，然后进行下一次检测。
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Representative Results
本协议中概述的方法用于构建sgRNA和xCas9表达载体，然后对具有相对较高的基因靶向效率的sgRNA寡基因进行优化筛选。在这里，我们展示了一个代表性的例子，3个sgRNA目标羊 DKK2 exon 1。SgRNA 和 xCas9 表达载体可以通过预消化向量骨干 （图2） 构建，然后通过退火寡头对将载体与一系列短的双链 DNA 片段连在一起。正菌落可以通过特定的底向对引导PCR检测（图3）。一个440bp的DNA片段从 羊DKK2 exon 1被子克隆成pSSA-双质粒15 使用双重消化与AscI和Sa利，导致pSSA-双DKK2。pX330-xCas9-T1、pX330-xCas9-T2和pX330-xCas9-T3的基因靶向能力被模拟检测（图5），然后最后一个sgRNA载体被确定为相对较好的载体，我们下一步为绵羊基因编辑研究挑选。
该检测方法将单股退火（SSA）机制（图1B和图4）与荧光素酶报告基因相结合，以监测DNA切割效率。如图4 所示，SSA是在两个朝同一方向的重复序列之间进行双链断裂时启动的过程。单股区域与延伸至重复序列的中断相邻，因此互补链可以相互退火。这种退火中间体可以通过消化单绞合的尾巴和填补缝隙来处理。双荧光素酶报告基因主要包括萤火虫磷酸盐和雷尼拉雷尼菲斯（也称为海盘）的荧光素酶基因。萤火虫和瑞尼拉荧光素酶的活性从单个样本中按顺序测量。当具有终止蛋白的识别区域在其中间不切割时，SSA 系统中的基因被阻塞，无法转化为功能蛋白。当处理过程中，SSA系统将自动合并同源序列，重叠序列成为单个序列，基因得到重组修复，然后在整个生成功能蛋白过程中读取。
图1：克隆过程不同步骤的示意图表示。
（A） sgRNA载体构造的示意图，改编自冯张实验室的协议（ B ）双荧光素酶报告器载体构建的示意图（以选择向量 pSSA-DKK2 为例），DNA片段 Rluc-、Rluc-2 和 Rluc-3 代表雷尼拉荧光素酶全长编码序列的三个部分。MCS 表示"多个克隆站点"。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 2：使用 BbsI 预消化矢量主干 pX330-xCas9。
1： Dna 标记， 2： pX330 - xcas9 质粒， 3： px330 - xCas9 质粒与 Bbsi 一起消化。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：用于DKK2-T1 sgRNA矢量检测的特定底向对引导PCR。
车道 1-7 分别指示 7 个不同菌落的 PCR 波段。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：单股退火（SSA）的示意图。请单击此处查看此图的较大版本。
图5：双荧光素酶测定与记者向量pSSA-DKK2在细胞系PIEC。
Ranilla 荧光素酶荧光酶活性在 PIEC 中因过度支出 pX330-xCas9-T1、pX330-xCas9-T2 或 pX330 xCas9-T3 而显著诱导（P<0.01，学生 t 测试），折叠变化为 3.15、5.84 或 13.10。误差条指示每个组的标准偏差 （SD）（n=3）。 请单击此处查看此图的较大版本。
| 名字 | 基因组DNA靶点（5'-3'） | sgRNA 奥利戈斯 （5'-3'） | ||
| T1 | Tgcctctctactggccgggg | T1 - f： Caccgtgctcgc | ||
| T1 - r： Acgcgggcagaggaggaggcac | ||||
| T2 | Atcaagtcctctcggg | T2 - f： 卡科加特卡格特克茨格 | ||
| T2 - R： Accccagaggacttgatc | ||||
| T3 | Gcccgagctgccgaactgtg | T3 - f： CACCGCGGGGCCGAACTG | ||
| T3 - r： Accagttcggcgcgcc | ||||
表1：sgRNA靶点和寡头，用于羊DKK2的基因编辑。
| PCR 组件 | 25 μL 反应 |
| 10 μM 前向底向（例如 T1-F） | 1 μL |
| 10 μM 反向底面 Bbsi-R | 1 μL |
| 10 倍 PCR 缓冲器 | 2.5 μL |
| 2.5 m dNTPs | 1 μL |
| 细菌液 | 1 μL |
| DNA塔克聚合酶 | 2.5 单位 |
| 无核酶水 | 高达 25 μL |
表2：用于阳性细菌菌落检测的PCR混合物。
| 试剂 | 体积 |
| pSSA-双向量（合成DNA片段或PCR产品） | 1-2 μg |
| 切割智能缓冲区 | 5 μL |
| 阿西 | 1 μL |
| 萨利-HF | 1 μL |
| 蒸馏水 | 高达 50 μL |
| 总体积 | 50 μL |
表3：pSSA-双向量和合成DNA片段（或PCR产品）的双重消化。
| 试剂 | 体积 |
| pSSA-双向量（预消化） | 0.5 μg |
| 含有 sgRNA 靶目标的 DNA 片段（预消化） | 0.2 μg |
| T4 DNA 利塞缓冲液 （10x） | 1 μL |
| T4 DNA 利加塞 | 1 μL |
| 蒸馏水 | 高达 10 μL |
| 总体积 | 10 μL |
表4：含有sgRNA靶点的DNA片段的结扎反应成消化不良的pSSA-双向量。
| 第1步：试剂制备 | |
| 转染试剂 | 2 μL |
表5：24井板中细胞转染的详细信息。
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Discussion
我们在此描述的 sgRNA 载体克隆程序有助于高效生产 sgRNA，大部分成本来自寡核苷酸排序和载体测序。虽然概述的方法旨在允许用户生成用于CRISPR/Cas9的sgRNA，但该协议可以很容易地适用于Cas9正交器或其他RNA引导的内核，如Cpf1，对载体骨干和寡核苷酸悬垂序列进行细微的修改。
上述协议将在10天内提供首选的sgRNA靶点，当从适当设计的寡核苷酸开始。这包括 sgRNA 设计 （1 小时， 步骤 1 - 2）， 稀释， 等分和退火的寡核苷酸 （30 分钟， 第3步），消化和纯化sgRNA表达载体（3小时，步骤4），将sgRNA寡核苷酸克隆成预消化空载体（过夜，步骤5-6），菌落的PCR检测（4-5小时，步骤7），以及sgRNA表达质粒序列的验证（24小时），步骤 8）。同时，双荧光素分析器矢量的构造和序列验证需要5~7d（步骤9）。细胞系、质粒转染和双荧光素酶检测的制备需要约48小时（步骤10-11）。生成每个质粒的故障率接近 0。
该协议最关键的步骤是限制性酶消化sgRNA载体的酶，如 BbsI。如果消化不足，那么细菌菌落的阳性率可能非常低。而基于PCR的检测方法可以灵敏地监测消化效率和阳性率。前向底像以前用作插入的 sgRNA 片段的向前寡头，确保了对右插入和空向量的高效区分。该策略的优点之一是，在DNA测序之前，PCR可以有效地检测阳性菌落。如上所述，与PCR相比，序列验证仍然相对昂贵，特别是当 BbsI的不完全消化 发生时。在资源节约方面，我们将 sgRNA 片段退火（如 T1-F、T2-F 或 T3-F）的前进寡头与用于 PCR 扩增的测序底像 BbsI-R 配对。通过这一菌落识别策略，实验室中已成功构建了500多个sgRNA载体。
该协议的另一个优点是使用双荧光素酶处理系统对候选sgRNA目标进行有效的预选。切割效率的巨大差异确实存在于不同的sgRNA目标4。通过T7E1测定或测量核酸酶1在难以转染的细胞系中识别高效的sgRNA靶点是耗费时间和费力的。此外，对于T7E1测定或测量核酸酶测定中的PCR扩增，有时很难具体放大基因组DNA中的目标序列，因为缺少合适的底转对1。相比之下，双荧光素分析分析是独立于基因组扩增程序。以前，我们曾使用此方法获取高度活跃的 sgRNA16，19。
尽管本文所述方法具有明显的优点，但还必须指出一些局限性。虽然它确保了高成功率，但由于需要合成目标序列，建议的基于荧光酶的sgRNA选择方法可能比其他方法（测量器/高分辨率熔体分析等）更昂贵。此外，这种方法不比这些替代方法之一快，因为需要克隆记者质粒，如果一个易于转染的细胞系将进行基因靶向。还必须澄清，该方法适合进行敲除，但不适合编辑特定的核苷酸。此外，只能评估双链中断，不能评估单链中断。
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Disclosures
提交人宣称他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
该项目由山东省一级草原科学学科计划、国家自然科学基金（31301936）资助。 31572383、公益农业科学研究专项基金（201403071）、国家奶制品质量安全风险评估重大专项（GJFP201800804）和青岛市民生科技项目（19-6-1-68-nsh， 14-2-3-45-nsh，13-1-3-88-nsh）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A new generation of full touch screen gradient PCR instrument | LongGene | A200 | Target gene amplification |
| AscI restriction enzymes | New England Biolabs | R0558V | Cutting target vectors |
| BbsI restriction enzyme | New England Biolabs | R0539S | Cutting target vectors |
| Clean workbench | AIRTECH | SW-CJ-2FD/VS-1300L-U | A partial purification device in the form of a vertical laminar flow, which creates a local high clean air environment |
| DH5α Competent Cells | TaKaRa | K613 | Plasmid vector transformation |
| Dual-Luciferas Reporter Assay System | Promega | E1910 | Dual-luciferas reporter assay |
| Electric thermostatic water bath | Sanfa Scientific Instruments | DK-S24 | Heating reagent by constant temperature in water bath |
| Electrophoresis | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | DYY-6C | Control voltage, current, etc. |
| Eppendorf Reference 2 | Eppendorf China Ltd. | Reference 2 | Accurately draw and transfer traces of liquid |
| Gel imaging analyzer | Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd. | WD-9413B | For the analysis of electrophoresis gel images |
| GloMax 20/20 Luminometer | Promega | E5311 | Detect dual luciferase activity |
| High speed refrigerated centrifuge | BMH | sigma 3K15 | Nucleic acid extraction and purification |
| Intelligent biochemical incubator | Sanfa Scientific Instruments | SHP-160 | Provide a suitable temperature environment for the enzyme digestion experiment |
| LB Broth Agar | Sangon Biotech | A507003-0250 | For the cultivation of E.coli |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Kit | Thermo Fisher | L3000015 | DNA Transfection |
| SalI restriction enzymes | New England Biolabs | R3138V | Cutting target vectors |
| SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit | Sangon Biotech | B518131-0050 | Recycling DNA fragments |
| SanPrep Column Plasmid Mini-Preps Kit | Sangon Biotech | B518191-0100 | Extraction of plasmid DNA |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202V | Link DNA fragment |
| TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0 | TaKaRa | 9761 | DNA purification |
| Vertical pressure steam sterilizer | JIBIMED | LS-50LD | High temperature and autoclave to kill bacteria, fungi and other microorganisms in laboratory equipment |
| Water bath thermostat | Changzhou Guoyu Instrument Manufacturing Co., Ltd. | SHZ-82 | Let the bacteria keep shaking, which is good for contact with air. |
References
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