Het gebruiken van dichtbijgelegen-infrarode fluorescentie en hoge resolutie het scannen om eiwituitdrukking in de knaagdieren hersenen te meten
Summary
Hier presenteren we een protocol dat near-infrarood kleurstoffen gebruikt in combinatie met Immunohistochemistry en hoge-resolutie scannen naar eiwitten in hersengebieden te testen.
Abstract
Neurowetenschappen is de studie van hoe cellen in de hersenen verschillende functies bemiddelen. Het meten van eiwitexpressie in neuronen en glia is van cruciaal belang voor de studie van de neurowetenschappen als cellulaire functie wordt bepaald door de samenstelling en activiteit van cellulaire eiwitten. In dit artikel beschrijven we hoe immunocytochemie kan worden gecombineerd met bijna-infrarood scannen met hoge resolutie om een semi-kwantitatieve maat van eiwitexpressie in verschillende hersengebieden te bieden. Deze techniek kan worden gebruikt voor enkele of dubbele eiwitexpressie in hetzelfde hersengebied. Het meten van proteïnen op deze manier kan worden gebruikt om een relatieve verandering in eiwituitdrukking met een experimentele manipulatie, moleculaire handtekening van het leren en geheugen, activiteit in moleculaire wegen, en neurale activiteit in veelvoudige hersenengebieden te verkrijgen. Met behulp van de juiste eiwitten en statistische analyse, functionele connectiviteit tussen hersengebieden kan ook worden bepaald. Gezien het gemak van de uitvoering immunocytochemie in een laboratorium, met behulp van immunocytochemie met near-infrarood hoge-resolutie scannen kan het vermogen van de neuro om neurobiologische processen te onderzoeken op een systeemniveau uit te breiden.
Introduction
De studie van neurowetenschappen betreft een onderzoek van hoe de cellen in de hersenen specifieke functies bemiddelen1. Deze kunnen worden cellulaire in de natuur, zoals hoe glia cellen verlenen immuniteit in het centrale zenuwstelsel of kan betrekken experimenten die gericht zijn om uit te leggen hoe de activiteit van neuronen in de dorsale Hippocampus leidt tot ruimtelijke navigatie. In brede zin wordt de cellulaire functie bepaald door de eiwitten die worden uitgedrukt in een cel en de activiteit van deze eiwitten2. Als gevolg daarvan, het meten van de expressie en/of activiteit van eiwitten in hersencellen zijn van cruciaal belang voor de studie van de neurowetenschappen.
Een aantal technieken zijn beschikbaar om eiwituitdrukking in de hersenen te meten. Deze omvatten in vivo methodes zoals positron emissie topografie voor receptor dichtheid3 en micro-dialyse voor kleine peptides4. Meer algemeen, ex vivo methoden worden gebruikt om de eiwitfunctie en expressie te onderzoeken. Deze omvatten massaspectrometrie technieken5, westelijke vlek en enzym-verbonden immunosorbent ASSAY (Elisa)6, en immunocytochemie7. Immunocytochemie wordt veel gebruikt op het gebied van neurowetenschappen. Deze techniek impliceert het gebruik van een primair antilichaam om een proteïne (of antigeen) van belang (b.v., c-FOS) en een geconjugeerd secundair antilichaam te ontdekken om het eiwit-primaire antilichamen complex te ontdekken (Figuur 1). Om opsporing van het eiwit-primaire antilichaam-secundair antilichamen complex toe te laten, hebben de secundaire antilichamen oxyderende agenten zoals mierikswortelperoxidase (HRP) die aan hen wordt vervoegd. Dit zorgt voor de vorming van precipitaten in cellen die kunnen worden gedetecteerd met behulp van lichte microscopie7. Secundaire antilichamen kunnen ook chemicaliën op te lichten geconjugeerde aan hen (dat wil zeggen, fluorophores). Wanneer bevorderd deze chemische producten licht uitstoten, dat kan worden gebruikt om proteïne-primair antilichaam-secundaire antilichamen complexen te ontdekken7. Ten slotte, soms hebben de primaire antilichamen het verminderen van agenten en fluorescentie chemische producten aan hen direct ontkennend de behoefte aan secundaire antilichamen7 (Figuur 1).
Interessant, vele immunocytochemie methodes staan voor visualisatie van proteïnen in hersenen cellen toe, maar niet de capaciteit om de hoeveelheid proteïne in een specifieke cel of een hersenengebied te kwantificeren. Het gebruik van lichte microscopie om precipitaten van reductiereacties op te sporen zorgt voor visualisatie van neuronen en glia, maar deze methode kan niet gebruikt worden om eiwitexpressie in cellen of in een specifiek hersengebied te kwantificeren. In theorie, kan de fluorescentie microscopie voor dit worden gebruikt, omdat het licht dat van het fluorescente secundaire antilichaam wordt uitgezonden een maatregel van het eiwit-primaire antilichaam-secundaire antilichamen complex is. Nochtans, kan autofluorescentie in hersenenweefsel het moeilijk maken om fluorescentie microscopie te gebruiken om eiwituitdrukking in hersenenweefsel te kwantificeren8. Dientengevolge, wordt het licht dat van fluorescente beelden van hersenenweefsel wordt uitgezonden zelden gebruikt om eiwituitdrukking in de hersenen te kwantificeren.
Veel van deze problemen kunnen worden aangepakt met behulp van near-infrarood immunocytochemie in combinatie met hoge-resolutie scannen9,10. In dit artikel beschrijven we hoe immunocytochemie in combinatie met fluorophores in de near-infrarood emissie Spectra gecombineerd kan worden met hoge resolutie scanning (bijv. 10 – 21 µm) om scherpe beelden te verkrijgen die een semi-kwantificering van eiwitten mogelijk maken in verschillende hersengebieden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De resultaten in dit artikel tonen aan dat near-infrarood immunocytochemie in combinatie met scannen met hoge resolutie kan worden gebruikt voor het verkrijgen van semi-kwantitatieve maatregelen van eiwitexpressie in hersenweefsel. Het kan ook worden gebruikt om twee eiwitten gelijktijdig label in hetzelfde hersengebied. We hebben eerder gebruikt near-infrarood immunohistochemistry te meten onmiddellijke vroege genexpressie in meerdere hersengebieden9,10. De dire…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het onderzoek in dit rapport werd gefinancierd door een doel subsidie van de NIGMS (1P20GM103653) toegekend aan DK.
Materials
| Brain Extraction | |||
| Anesthesia Induction Chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530SM | |
| Kleine Guillotine | Harvard Apparatus | 73-1920 | |
| Friedman Rongeur | Fine Science Tools | 16000-14 | used to remove back of skull |
| Delicate Dissecting Scissors | Fischer Scientific | 08-951-5 | used to cut upward along midline of skull |
| Micro Spatula | Fischer Scientific | 21-401-5 | used to scoop out brain |
| Glass Microscope Slides | Fischer Scientific | 12-549-6 | |
| Immunohistochemical Reaction | |||
| Triton X-100 | Used as a mild detergent to permeabilize cells after fixing in Paraformaldehyde, also used as mild detergent in combination with host serum and secondary antibody | ||
| Tween-20 | Used as a small amount of detergent added to TBS to procuce TBS-T after coverslipping slides with primary antibody | ||
| Licor Odyssey scanner | Licor Biotechnology Inc. | ||
| Image Studio | Licor Biotechnology Inc. | ||
Referências
- Kandel, E. R. . Principles of Neural Science. , (2013).
- Byrne, J. H., Roberts, J. L. . From Molecules to Networks: An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience. , (2009).
- Salami, A., et al. Dopamine D2/3 binding potential modulates neural signatures of working memory in a load-dependent fashion. Journal of Neuroscience. , (2018).
- Merali, Z., Khan, S., Michaud, D. S., Shippy, S. A., Anisman, H. Does amygdaloid corticotropin-releasing hormone (CRH) mediate anxiety-like behaviors? Dissociation of anxiogenic effects and CRH release. European Journal of Neuroscience. 20 (1), 229-239 (2004).
- English, J. A., et al. Dataset of mouse hippocampus profiled by LC-MS/MS for label-free quantitation. Data in Brief. 7, 341-343 (2016).
- David, M. A., Tayebi, M. Detection of protein aggregates in brain and cerebrospinal fluid derived from multiple sclerosis patients. Frontiers in Neurology. 5, 251 (2014).
- Oliver, C., Jamur, M. C. Immunocytochemical methods and protocols. Methods in Molecular Biology. , (2010).
- Spitzer, N., Sammons, G. S., Price, E. M. Autofluorescent cells in rat brain can be convincing impostors in green fluorescent reporter studies. Journal of Neuroscience Methods. 197 (1), 48-55 (2011).
- Knox, D., et al. Using c-Jun to identify fear extinction learning-specific patterns of neural activity that are affected by single prolonged stress. Behavioural Brain Researach. 341, 189-197 (2018).
- Knox, D., et al. Neural circuits via which single prolonged stress exposure leads to fear extinction retention deficits. Learning & Memory. 23 (12), 689-698 (2016).
- Malinow, R., Malenka, R. C. AMPA receptor trafficking and synaptic plasticity. Annual Review of Neuroscience. 25, 103-126 (2002).
- Nabavi, S., et al. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
- Kimmelmann-Shultz, B., Mohammadmirzaei, N., Della Valle, R., Knox, D. Using high resolution near infrared imaging to measure fear-learning induced changes in AMPA/NMDA ratios throughout the fear circuit. , (2018).
- Eagle, A. L., et al. Single prolonged stress enhances hippocampal glucocorticoid receptor and phosphorylated protein kinase B levels. Neuroscience Research. 75 (2), 130-137 (2013).
